背景及概述^[1-2]

β-生育酚是維生素E的一種。維生素E包括生育酚和三烯生育酚兩類共8種化合物，即α、β、γ、δ生育酚和α、β、γ、δ三烯生育酚。維生素E用作醫(yī)藥，對防止動脈硬化、貧血、肝病、癌癥等均有良好的醫(yī)用價值;作為動物飼料添加劑，可提高繁殖能力;在食品方面用作方便面、人造奶油、奶粉、油脂等的抗氧化劑，也可與維生素A、維生素A脂肪酸酯等配合使用。

應用^[1]

一種抗氧化劑組合物，包括如下組分：組分1：天然維生素E混合生育酚，組分2：α-生育酚；所述天然維生素E混合生育酚為含有α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的天然維生素E抗氧化劑；本發(fā)明天然維生素E復合抗氧化劑不僅具有良好的抗氧化效果，同時屬于天然綠色抗氧化劑，對人體無毒無害。在室溫下，α-生育酚抗氧化能力較強；而在高溫條件下，γ-生育酚和δ-生育酚則具有更長的持續(xù)抗氧化能力，兩者復配產(chǎn)生協(xié)效作用，能夠顯著提高食品級白油的抗氧化能力。

檢測方法^[1]

維生素E主要為生育酚，包括α、β、γ、δ四種形式。脂溶性維生素包括視黃醇、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚。一種同時檢測5種脂溶性維生素的方法如下：

步驟一、溶液的配置與標定

(1)標準品的配制

取200μL濃度為5mg/mL的α-生育酚、20μL濃度為50mg/mL的β-生育酚、200μL濃度為1mg/mL的γ-生育酚、20μL濃度為50mg/mL的δ-生育酚和560μL濃度為0.1％的BHT色譜甲醇，混合均勻，得到1mg/mL維生素E標準品；

取50μL濃度為1mg/mL的視黃醇、500μL濃度為1mg/mL的維生素E標準品和450μL濃度為0.1％的BHT色譜甲醇，渦旋混合均勻，得到含有50μg/mL維生素A和500μg/mL維生素E的混合標準品。

-80℃避光條件下保存3個月，避免反復凍融。

(2)標準品的標定

吸取20μL含有50μg/mL維生素A和500μg/mL維生素E的混合標準品，置于5mL容量瓶中，用無水乙醇定容后，用紫外分光光度計標定標準品濃度，分別在視黃醇、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的紫外吸收波長下測定其紫外吸光值，根據(jù)公式(1)和(2)計算標準品的實際濃度，整個過程避光操作，其中，C為待標定的標準品的實際濃度，單位為g/100mL，A為紫外吸收波長下測定的標準品的吸光度平均值，E為待測樣本的1％標準比吸光系數(shù)。

C＝A/E×稀釋倍數(shù)(1)

稀釋倍數(shù)＝10000×5mL/20μL(2)

(3)標準品的稀釋

將標準品采用0.1％BHT甲醇溶液進行梯度稀釋，得到濃度分別為0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL和50μg/mL的標準品溶液。-80℃避光條件下保存3個月，避免反復凍融。

(4)內(nèi)標工作液的配置

精確稱取2mg五氘代視黃醇，置于10mL容量瓶中，用無水乙醇定容至10mL，得到200μg/mL五氘代視黃醇溶液；精確稱取2.5mg六氘代α-生育酚，置于5mL容量瓶中，用無水乙醇定容至5mL，得到500μg/mL六氘代α-生育酚溶液。標定方法與標準品的標定方法相同。

步驟二、樣品預處理

將包含0.125μg/mL五氘代視黃醇和1.25μg/mL六氘代α-生育酚的內(nèi)標工作液加入待測樣品，純水或甲酸水溶液稀釋后，加入乙醇、甲醇或乙腈溶液，渦旋混勻高速離心去除蛋白質(zhì)，加入正己烷萃取，渦旋混勻離心取上清液，將所述上清液常溫氮氣吹干，加入復溶溶液，渦旋混勻離心，得到的上清液即為預處理的樣品。

步驟三、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

將7μL預處理的樣品加入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的進樣瓶中，色譜柱采用島津C18柱，規(guī)格為5μm×2.1μm×50mm，色譜柱的溫度為25℃，色譜柱采用梯度洗脫方式，梯度洗脫的流動相采用甲酸銨-乙腈混合液，流動相的流速為0.5mL/min，梯度洗脫的時間為6min，其中，梯度洗脫的條件如表1所示，具體為：第0-0.3min內(nèi)，流動相恒定為50％甲酸銨和50％乙腈；第0.3-0.6min內(nèi)，甲酸銨的體積百分比由50％連續(xù)減小至5％，乙腈的體積百分比由50％連續(xù)增大至95％；第0.6-1.8min內(nèi)，流動相恒定為5％甲酸銨和95％乙腈；第1.8-2min內(nèi)，甲酸銨的體積百分比由5％連續(xù)減小至2％，乙腈的體積百分比由95％連續(xù)增大至98％；第2-5min內(nèi)，流動相恒定為2％甲酸銨和98％乙腈；第5-5.2min內(nèi)，甲酸銨的體積百分比由2％連續(xù)增大至50％，乙腈的體積百分比由98％連續(xù)減小至50％；第5.2-6min內(nèi)，流動相恒定為50％甲酸銨和50％乙腈。

步驟四、線性關(guān)系和定量限

對濃度分別為0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL和50μg/mL的標準品溶液進行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，以色譜峰面積為縱坐標，以分析物的濃度為橫坐標，繪制標準品曲線，線性權(quán)重取1/x，結(jié)果見表3。

表3五種分析物的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

 結(jié)果表明，視黃醇、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的濃度與其對應的色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，得到的線性范圍和臨床可報告范圍相同：視黃醇的線性范圍和臨床可報告范圍為0.05-5μg/mL，γ-生育酚的線性范圍和臨床可報告范圍為0.1-10μg/mL，α-生育酚、β-生育酚和δ-生育酚的線性范圍和臨床可報告范圍為0.5-50μg/mL。

步驟五、回收率和精密度

分別取維生素A和維生素E內(nèi)標工作液，制備得到3種濃度的樣品進行加樣回收率和精密度實驗。

主要參考資料

[1]CN201510777349.0抗氧化劑組合物及其應用

[2][中國發(fā)明]CN201810240542.4一種同時檢測5種脂溶性維生素的方法及應用