背景[1-6]
分選磁珠是基于SPRI(SolidPhaseReverseImmobilization)原理，配合精心優(yōu)化過的緩沖體系，可用于二代測(cè)序文庫構(gòu)建過程中的DNA片段分選、純化?？蛇m用于各品牌的DNA、RNA建庫試劑盒。分選磁珠的作用原理是基于一種固相載體可逆化固定（SPRI）的分離純化方法。磁珠體系中一般包含：磁珠、DNA、聚乙二醇（PEG）、以及鹽離子等，在一定濃度的PEG和鹽離子環(huán)境中，DNA可吸附到羧基修飾的高分子磁珠表面（即固相載體），該過程是可逆的，在適當(dāng)條件下，結(jié)合的DNA分子可以被洗脫回收。
納米級(jí)別的磁珠表面性質(zhì)不同，分離原理也不盡相同，但基本上固態(tài)的球狀材料組成并無太大差異，基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)一般分為3層，最內(nèi)層的核心是聚苯乙烯、第二層包裹磁性物質(zhì)——四氧化三鐵（Fe3O4），最外層表面是羧基（-COOH）修飾的高分子材料所構(gòu)成，其中羧基行使與核酸結(jié)合的工作。在整個(gè)體系中，PEG是影響DNA回收的決定性因素（其他因素還包括DNA大小和濃度、鹽離子濃度、孵育時(shí)間等等）。
DNA在一定濃度的PEG存在條件下，NaCl或MgCl2促進(jìn)條件下，使DNA發(fā)生脫水反應(yīng)，分子構(gòu)象會(huì)發(fā)生急劇變化，由線狀被壓縮形成卷曲球狀，繼而聚集沉淀，同時(shí)隨PEG分子量、濃度以及鹽濃度的不同，不同長(zhǎng)度的DNA可以被選擇性的沉淀出來。在磁珠體系中，特定分子量的PEG的功能主要是與鹽離子共同作用，改變不同長(zhǎng)度DNA的分子構(gòu)象，同時(shí)增加體系的粘稠程度，使磁珠存在其中處于懸浮狀態(tài)，不易沉降，增加磁珠在空間位置的碰撞與排斥，從而增加核酸與磁珠的聚集效率與效果，除此之外，PEG與蛋白質(zhì)具有相容性，也可去除樣品中的蛋白質(zhì)。當(dāng)處于PEG和鹽離子環(huán)境中的DNA，因脫水作用而發(fā)生分子構(gòu)象改變后，會(huì)暴露出磷酸骨架上大量的帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)，與表面帶負(fù)電荷的羧基磁珠結(jié)合，但如何解釋負(fù)負(fù)電荷之間的作用，目前還不得而知。
但普遍認(rèn)為，這是由于帶正電荷的鹽離子的作用（如Na+）。帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)借由解離的鹽離子（如Na+）與羧基形成離子橋，使DNA被特異性吸附到羧基磁珠表面。當(dāng)PEG和鹽類被去除之后，加入水性分子，會(huì)快速充分水化DNA，解除其三者之間的離子相互作用，使得吸附到磁珠的DNA被純化出來。磁珠的出現(xiàn)，使得核酸制備的實(shí)驗(yàn)可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，同時(shí)相較于傳統(tǒng)的回收方式，還具有3個(gè)明顯的優(yōu)勢(shì)：1）效率更高，以DNA為例，1μL磁珠的承載量可達(dá)7μg；2）避免使用有機(jī)溶劑，如酚類、氯仿等等，更加安全；3）操作簡(jiǎn)單，無需離心，也更有利于保留核酸的完整性。
應(yīng)用[7][8]
用于重組酶介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中的應(yīng)用
重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（recombinase ploymerase amplification,RPA）是基于重組酶聚合酶介導(dǎo)的擴(kuò)增原理，模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的酶反應(yīng)過程，對(duì)DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，可在39℃左右的恒溫條件下，20分鐘內(nèi)完成擴(kuò)增反應(yīng)。結(jié)合DNA快速提取技術(shù)，可使轉(zhuǎn)基因作物在野外快速檢測(cè)中具有廣泛的應(yīng)用前景。
結(jié)果如下：
1.RPA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)研究：本研究選取了幾種轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中的常用靶標(biāo)原件，如CaMV35S啟動(dòng)子、nos終止子、HPT基因以及Bt基因等，建立了RPA的凝膠和熒光快速檢測(cè)方法。結(jié)果證實(shí)，基于探針檢測(cè)的熒光RPA方法具有較高的靈敏度，可以穩(wěn)定檢測(cè)到100個(gè)分子拷貝數(shù)。同時(shí)熒光RPA方法適用性強(qiáng)，可以用于不同轉(zhuǎn)基因作物的成分檢測(cè)。15-25分鐘內(nèi)便可以得到穩(wěn)定、可靠的檢測(cè)結(jié)果。
2.磁珠快速提取植物DNA方法的建立：本研究利用三種便攜式DNA提取裝置，通過對(duì)提取條件的優(yōu)化，開發(fā)出植物總DNA快速粗提取方法。該方法可以在室溫條件下，20分鐘內(nèi)完成不同植物DNA的提取。結(jié)果證實(shí)磁珠法快速提取植物基因組DNA可以用于PCR檢測(cè)，同時(shí)還可以對(duì)0.1%的轉(zhuǎn)基因玉米MON810進(jìn)行品系特異性檢測(cè)。后續(xù)研究進(jìn)一步結(jié)合RPA熒光檢測(cè)技術(shù)，成功的對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1進(jìn)行了nos終止子和Bt基因成分檢測(cè)，建立了適用于野外檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因作物快速精準(zhǔn)檢測(cè)方法。
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