背景^[1-6]

DPN I甲基化模板消化酶可有效識(shí)別并切斷腺嘌呤甲基化的GmATC，而不能切斷非甲基化的GATC序列。從（dam+）菌株中提取的質(zhì)粒因已經(jīng)被甲基化，可作為Dpn I的底物。該產(chǎn)品可廣泛應(yīng)用于分子克隆、基因分型、DNA印跡、RFLP技術(shù)、SNP等多項(xiàng)技術(shù)領(lǐng)域。酶切位點(diǎn)：5'GAm6↓TC 3'、3'CT↑Am6G 5'。原核細(xì)胞為了保護(hù)自己，選擇性地降解外源DNA，可保護(hù)個(gè)體免于外來(lái)DNA（如噬菌體）侵入的系統(tǒng)，主要由限制內(nèi)切酶和甲基化酶組成的二元系統(tǒng)。限制內(nèi)切酶負(fù)責(zé)降解進(jìn)入原核細(xì)胞的外源DNA，甲基化酶則對(duì)細(xì)胞自身的DNA進(jìn)行甲基化，從而保護(hù)細(xì)胞的DNA，使其不被自己細(xì)胞內(nèi)的限制性核酸內(nèi)切酶降解。

除了上述限制性修飾系統(tǒng)，DNA甲基化在調(diào)節(jié)基因組復(fù)制，錯(cuò)配修復(fù)和促進(jìn)/抑制蛋白表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮作用。參與這些過(guò)程的甲基化酶（如Dam和Dcm甲基化酶）與限制性修飾系統(tǒng)是獨(dú)立的，但仍然可以影響某些限制性內(nèi)切酶是否能有效地切開(kāi)DNA。盡管不是所有的原核DNA有著相同的甲基化水平，但是在酶切消化的時(shí)候還是要考慮甲基化的影響。盡管有些甲基化酶不屬于限制性修飾系統(tǒng)，但是他們識(shí)別的序列和有些內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)重合，從而抑制了這些酶的酶切功能。

比如XbaI的識(shí)別序列是TCTAGA，如果在該序列前面有GA緊鄰或者該序列后面有TC接著，那么Dam的甲基化作用會(huì)使得XbaI切不開(kāi)該位點(diǎn)。相反地，DpnI酶切要發(fā)揮活性則需要DNA發(fā)生甲基化。DpnI酶在定點(diǎn)突變中是一個(gè)很常用的酶，它一般用于老的DNA模板的去除。而這些老的DNA模板需要從dam+的大腸桿菌中提取才行，這樣提取的DNA質(zhì)粒上的GATC序列會(huì)帶上甲基化修飾，剛好可以被DpnI酶給消化掉。而通過(guò)PCR擴(kuò)增出來(lái)的新的DNA模板則會(huì)被保留。

應(yīng)用^[7][8]

DPN I甲基化模板消化酶可用于蛋白激酶CDK8絲氨酸乙?；捌涔δ艿难芯?/h3>

通過(guò)本次試驗(yàn)確認(rèn)蛋白激酶CDK8絲氨酸位點(diǎn)存在乙酰化修飾,并且進(jìn)一步探討蛋白激酶CDK8絲氨酸乙?；揎棇?duì)其磷酸化下游底物CTD結(jié)構(gòu)域的影響。方法：

1.根據(jù)Open Resarch結(jié)果,確認(rèn)真核細(xì)胞中內(nèi)源性蛋白激酶CDK8絲氨酸位點(diǎn)的乙?；禾崛?93T細(xì)胞總蛋白,IP純化內(nèi)源性CDK8,通過(guò)液-質(zhì)連用質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS)檢測(cè)所有氨基酸位點(diǎn)乙?；揎椢稽c(diǎn),了解蛋白激酶CDK8絲氨酸乙酰化修飾在功能區(qū)的分布狀態(tài)及比例。

2.檢測(cè)外源性蛋白激酶CDK8在原核細(xì)菌中的絲氨酸的乙?；揎棧簶?gòu)建PQE30-His-CDK8重組質(zhì)粒,通過(guò)IPTG誘導(dǎo)劑使外源性CDK8質(zhì)粒在原核細(xì)菌BL21中表達(dá),Ni柱純化外源性CDK8,LC-MS/MS技術(shù)檢測(cè)該蛋白絲氨酸乙?；揎椙闆r。

3.檢測(cè)外源性蛋白激酶CDK8在真核細(xì)胞中的絲氨酸的乙?；揎棧簶?gòu)建PCDNA3.0-Flag-CDK8重組質(zhì)粒,通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù)把質(zhì)粒導(dǎo)入293T細(xì)胞進(jìn)行表達(dá),免疫沉淀技術(shù)純化外源性CDK8,LC-MS/MS技術(shù)檢測(cè)該蛋白絲氨酸乙?；揎棥?/p>

4.檢測(cè)蛋白激酶CDK8的絲氨酸乙?；揎棇?duì)其磷酸化功能的影響：①構(gòu)建PCDNA3.0-Flag-CDK8突變質(zhì)粒[突變位點(diǎn)是把蛋白激酶CDK810、11位上的絲氨酸分別突變成丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C),通過(guò)轉(zhuǎn)染把質(zhì)粒導(dǎo)入293T細(xì)胞表達(dá),免疫沉淀技術(shù)純化外源性CDK8。②構(gòu)建PQE30-His-CTD質(zhì)粒,將表達(dá)的CTD蛋白與突變的蛋白激酶CDK837℃孵育一小時(shí),LC-MS/MS技術(shù)檢測(cè)CTD蛋白的磷酸化修飾情況。鑒定蛋白激酶CDK8激酶10、11位絲氨酸乙?；揎棇?duì)蛋白激酶CDK8激酶磷酸化功能的影響。

結(jié)論1.證實(shí)了真核細(xì)胞或原核細(xì)菌中蛋白激酶CDK8絲氨酸都廣泛存在乙酰化修。許多乙酰化修飾位點(diǎn)已被證實(shí)可以發(fā)生磷酸化修飾,這揭示了絲氨酸位點(diǎn)的乙?；土姿峄揎椏赡艽嬖诟?jìng)爭(zhēng)關(guān)系。2.CDK8第10、11位絲氨酸乙?；土姿峄揎椀膭?dòng)態(tài)平衡會(huì)影響該蛋白對(duì)下游底物CTD結(jié)構(gòu)域的磷酸化功能。

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