背景及概述[1]
臭靈丹(Laggerapterodonta)菊科六棱菊屬植物，又名鹿耳林或大黑藥，以根或全草入藥，全草有小毒。夏秋采收，洗凈，鮮用或曬干。全株有強烈臭氣。始載于《滇南本草》“其味苦、辛，性寒，有毒。陰中之剛也，治風熱積毒，臟腑不和。通行十二經(jīng)絡(luò)，發(fā)散瘡癰”，分布于云南、四川、西藏等地，云南彝族首先使用其入藥，具有清熱解毒、消腫排膿之功效，且應(yīng)用廣泛。臭靈丹中的桉烷型倍半萜化合物多為桉烷型倍半萜酸、桉烷型倍半萜醇及桉烷型倍半萜苷類化合物，目前已從臭靈丹中分離、鑒定30余種桉烷型倍半萜類化合物，其中桉烷型倍半萜酸主要包括臭靈丹酸、臭靈丹酮酸、2α，3β－二羥基－臭靈丹酸等，以臭靈丹酸為主；桉烷型倍半萜醇主要包括臭靈丹二醇、臭靈丹三醇甲及臭靈丹三醇乙等，以臭靈丹二醇為主；桉烷型倍半萜苷類化合物是由桉烷型倍半萜取代羥基而形成的糖苷類化合物。
制備[2-3]
方法1：一種從臭靈丹中提取臭靈丹酸的工藝，步驟包括：將臭靈丹根烘干至含水低于13％，取1kg粉碎至40目，得臭靈丹粉末，以5％氫氧化鈉水溶液6L室溫下浸提12小時，過濾得浸取液，加入2％醋酸酸化至pH為2，得沉淀物；收集沉淀物，將沉淀物以氯仿萃取3次，將氯仿層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮至萃取體積的1/20，加入大孔樹脂成粉末狀，然后上大孔吸附樹脂柱進行柱層析，用體積比為3∶1的乙酸乙酯和甲醇的混合洗脫液進行洗脫；收集富集臭靈丹酸的流分，濃縮后再加入大孔樹脂拌樣上柱，用體積比為6∶1、3∶1、1∶1的石油醚-乙酸乙酯的混合溶劑進行梯度洗脫，收集流分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮得臭靈丹酸，含量為87％，進一步用少量丙酮溶解所得產(chǎn)物，重結(jié)晶得到純度98.7％的無色晶體。
方法2：取臭靈丹干燥藥材(采自昆明市近郊)1kg，通過90％酒精滲漉提取得浸膏135g；浸膏加800ml水攪拌使混懸，依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取(各5×500ml)，回收溶劑；將石油醚提取物加硅膠適量拌樣，干法裝柱(200～300目，650g)，常壓下用石油醚‐醋酸乙酯混合溶劑梯度洗脫，溶劑配比依次為1：0、20：1、10：1和5：1；分別接收，濃縮；石油醚洗脫段重約3.8g，繼續(xù)用硅膠柱層析反復(fù)分離，交替使用石油醚和氯仿洗脫，用TLC指導(dǎo)合并(碘熏顯色)，濃縮，得到白色結(jié)晶性粉末(0.1g)，經(jīng)NMR波譜解析鑒定為臭靈丹酸。
應(yīng)用[3-4]
臭靈丹酸具有抗菌、抗腫瘤等生物活性。
1)抑菌作用：對臭靈丹進行幽門螺桿菌的體外抑菌實驗，結(jié)果顯示臭靈丹水浸泡提取物具有明顯抑菌效果。使用濾紙擴散法檢測臭靈丹酸、臭靈丹二醇抑菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此兩種化合物具有明顯抑制金黃色葡萄球菌、草分支桿菌、枯草芽胞桿菌、銅綠假單孢菌、環(huán)狀芽胞桿菌的作用。
2)抗病毒實驗：本發(fā)明采用細胞病變抑制法在治療模式下驗證臭靈丹酸對流感病毒復(fù)制的抑制作用，以奧司他韋為陽性對照藥，觀察臭靈丹酸對MDCK細胞的毒性以及對流感病毒復(fù)制的抑制作用。利用MTT法測得臭靈丹酸的半數(shù)有毒濃度(TC)為278.9μg/mL，臭靈丹酸抑制多個亞型流感病毒(A/PR/8/34、09H1N1、季H1N1等)的半數(shù)有效濃度IC為9.47～37.14μg/mL，證實臭靈丹酸在治療模式下對流感病毒有明顯抑制作用，其選擇指數(shù)SI＝7.5～29.5，為低毒高效。流感病毒神經(jīng)氨酸酶(NA)抑制實驗表明臭靈丹酸對NA的抑制活性，IC＝668.1μg/ml。免疫熒光實驗顯示臭靈丹酸(100μg/mL)可抑制流感病毒RNPs核輸出。
3)抗炎實驗：應(yīng)用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NF‐κB啟動熒光素酶表達的報告質(zhì)粒的HEK293細胞系研究臭靈丹酸對流感病毒誘導(dǎo)的與病毒復(fù)制相關(guān)信號通路的調(diào)控作用，分別用20ng/ml的TNF-α和流感病毒H1N1刺激，同時給予不同劑量臭靈丹酸(20μg/ml、40μg/ml)干預(yù)，均發(fā)現(xiàn)藥物可抑制NF‐κB介導(dǎo)的熒光素酶的表達，并呈劑量依賴關(guān)系。提示藥物具有抑制NF‐κB信號通路活化的藥理活性。由于NF‐κB信號通路激活與促炎因子的高表達密切相關(guān)，因此通過qRT-PCR方法測定臭靈丹酸對于流感病毒感染后介導(dǎo)的促炎因子表達的實驗證實，不同劑量臭靈丹酸(6.25μg/ml、25μg/ml、100μg/ml)能夠明顯抑制H1N1病毒和H9N2病毒感染A549細胞炎癥因子(IL-6、IP-10、MIP-1、MCP-1)的異常表達，并呈劑量依賴關(guān)系。
主要參考資料
[1] 云南民間常用藥臭靈丹的研究概述
[2] CN201010293234.1一種從臭靈丹中提取臭靈丹酸的工藝
[3] CN201710544207.9臭靈丹酸在制備預(yù)防或治療流感藥物中的應(yīng)用
[4] 云南彝族藥臭靈丹藥用價值研究進展