本文主要是提供一種實(shí)用的肝細(xì)胞提取方式，為從事病毒性肝炎、肝硬化和肝癌方面。以及少數(shù)從事肝臟的遺傳性代謝疾病、免疫性肝病、藥物和化學(xué)中毒性肝病、肝血管性疾病等研究者提供一些參考。

實(shí)驗(yàn)方法 

小鼠肝臟的原位灌洗 用60ml注射器吸取已預(yù)溫至37℃ 的原代肝 細(xì)胞分離液 Ｉ 并連接好靜脈輸液針與注射器，并將 注射器固定在注射泵插槽內(nèi)，白熾手術(shù)燈距其約20cm加熱，進(jìn)行保溫。將預(yù)凍冰袋置于不銹鋼托盤(pán) 上。小鼠經(jīng)脫臼處死后，立即用注射器針頭固定四 肢置于不銹鋼托盤(pán)的冰袋上，用 75％ 乙醇消毒腹部皮膚，“Ｕ”形切口剪開(kāi)小鼠腹部、胸，并沿胸廓外沿剪開(kāi)，完全剪開(kāi)隔肌，暴露胸、腹器官，并可視心臟 下腔靜脈，用平口鑷將腹部臟器向右外側(cè)牽拉，暴露并識(shí)別肝門(mén)靜脈。步灌洗，用止血鉗結(jié)扎小鼠肝前靜脈及心臟下腔靜脈后，用靜脈輸液針穿刺肝后靜脈，進(jìn)入約5mm，并同時(shí)用小動(dòng)脈夾固定穿刺入針頭前端約3mm位置，剪開(kāi)肝門(mén)靜脈，隨后開(kāi)始灌注肝細(xì)胞分離液 Ｉ，設(shè)定流速為6ml／min，灌注體積為20ml／只，灌流方向從肝后靜脈進(jìn)入，從肝門(mén)靜脈流出，行逆行灌注；可見(jiàn)肝門(mén)靜脈缺口有大量血液流出（如圖 １Ａ），并逐漸減少，肝臟完全變?yōu)橥粱疑?第二步灌洗，待步灌洗結(jié)束后，隨即改用已預(yù)溫至37℃ 的原代肝細(xì)胞分離液 ＩＩ 進(jìn)行灌洗，設(shè)定流速為3ml／min，灌注體積為20ml／只，可見(jiàn)肝門(mén)靜脈缺口已無(wú)血液流出，液體清亮，肝臟逐漸變?yōu)橥咙S色（如圖 1B,體積明顯膨脹，用平口鑷輕觸肝臟表面可見(jiàn)不可復(fù)原小坑出現(xiàn)。

注：Ａ：步灌洗開(kāi)始；   Ｂ：第二步灌洗結(jié)束。

 小鼠肝臟的酶消化 

用眼科手術(shù)剪無(wú)菌剝離全肝（去除膽囊部分）,經(jīng)4℃ ，含 1％ FBS的無(wú)菌PBS溶液漂洗后，迅速轉(zhuǎn)至盛有已預(yù)熱至37℃ 的肝細(xì)胞分離液 ＩＩＩ 的 15ml 大玻璃平皿；將小鼠肝臟經(jīng)眼科剪剪至大小1mm 3后轉(zhuǎn)入37℃水浴鍋消化15min；立即向每個(gè)肝臟加入5ml DMEM培養(yǎng)基（含10％ FBS）混勻，中止酶消化。 

單細(xì)胞懸液的制備 

消化處理后的肝組織懸液經(jīng)100μｍ 細(xì)胞濾器過(guò)濾后，再經(jīng)4℃ 的肝細(xì)胞分離用洗滌緩沖液補(bǔ)充體積至30ml，4℃，750ｒ／min，5min離心；吸棄上清，再加入5ml肝細(xì)胞分離用洗滌緩沖液，4℃，750ｒ／min，3min離心，洗滌2次，目視上清無(wú)明顯渾濁出現(xiàn)。

肝細(xì)胞的密度梯度離心分離

 沿管壁加入5ml 10％ Opti Prep，用微量移液器吹打至獲得的細(xì)胞沉渣均勻分布，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌15ml離心管內(nèi)；再在上層加入5ml肝細(xì)胞分離用洗滌緩沖液，不混勻，標(biāo)記并立即進(jìn)行4℃，750ｒ／min，10min離心，吸棄上清后，再加入肝細(xì)胞分離用洗滌緩沖液2ml，４℃，750ｒ／min，2 離心洗滌，獲得肝細(xì)胞。

原代肝細(xì)胞的貼壁培養(yǎng) 

向獲得的肝細(xì)胞沉淀中加入1ml DMEM培養(yǎng)基（含10％ FBS）后，混勻，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞濃度，按接種密度為2×105個(gè)／ml立即接種于預(yù)包被有大鼠鼠尾膠蛋白的六孔板或細(xì)胞培養(yǎng)皿中。每個(gè)培養(yǎng)皿所加培養(yǎng)基以視培養(yǎng)基厚度為1.6～1.8mm為準(zhǔn)，于37℃ ，5％ co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2h后細(xì)胞貼壁，吸棄上清，加入1ml DMEM培養(yǎng)基（含10％ FBS） 小心洗滌未貼壁細(xì)胞， 再加入DMEM培養(yǎng)基（含10％ FBS），37℃，5％ CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)（如圖 2）。

圖 ２ 肝細(xì)胞培養(yǎng) ２４ ｈ 后形態(tài)（ × ４０）

TC20 自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算 

分離后獲得的肝細(xì)胞純度檢測(cè)采用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)，對(duì)FITC標(biāo)記細(xì)胞角蛋白18（ cytokeratin18）抗體（FITC?At18）標(biāo)記的肝細(xì)胞進(jìn)行分析，即分離后的肝細(xì)胞懸液約100μＬ，分別加入2支無(wú)菌15ml離心管內(nèi)，標(biāo)記為陰性對(duì)照 （negative control,NC）管和 FITC?At18標(biāo)記的肝細(xì)胞（FITC?At18?HC） 管，再分別加入1ml 4％ 多聚甲醛，4℃，避光固定15min后，分別加入1ml PBS 溶液，混勻，4℃，750ｒ／min，3min離心，如此洗滌3次；加入3％BSA，４℃，封閉30min后，4℃，750ｒ／min，3min離心，吸棄上清，再加入 500μＬ 按FITC標(biāo)記抗細(xì)胞角蛋白18抗體原液：3％BSA（V／V） ＝ 1∶300稀釋后的抗體，４℃，避光過(guò)夜孵育；次日，每次以1ml PBS溶液進(jìn)行洗滌，4℃，750ｒ／min，3min離心，洗滌3次，再加入200μＬPBS溶液，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

原代肝細(xì)胞的活力分析

分離肝細(xì)胞的活力分析（臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)）：取0.2ml 4％臺(tái)盼藍(lán)母液，加入1.8ml PBS溶液中，稀釋為0.4％ 作為臺(tái)盼藍(lán)工作液。取分離后的原代肝細(xì)胞懸液約100μＬ 加入1支無(wú)菌1.5ml離心管４℃ ，封閉30min后，4℃，750ｒ／min，3min離心，吸棄上清，再加入500μＬ按FITC 標(biāo)記抗細(xì)胞角蛋白18抗體原液：3％BSA（V／ V） ＝1:300稀釋后的抗 體，4℃，避光過(guò)夜孵育；次日，每次以1ml PBS溶液進(jìn)行洗滌，4℃，750ｒ／min，3min離心，洗滌3次，再加入200μＬPBS溶液，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

原代肝細(xì)胞的活力分析 

分離肝細(xì)胞的活力分析（臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)）：取0.2ml 4％ 臺(tái)盼藍(lán)母液，加入108ml PBS溶液中， 稀釋為0.4％ 作為臺(tái)盼藍(lán)工作液。 取分離后的原代肝細(xì)胞懸液約100μＬ加入1支無(wú)菌1.5ml離心管內(nèi)，加入0.9ml 0.4％ 臺(tái)盼藍(lán)工作液，3min染色后，利用TC20自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)未被染色的細(xì)胞數(shù)，得活細(xì)胞數(shù)及活細(xì)胞率。

結(jié)果

純度分析通過(guò)TC20自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算，細(xì)胞濃度為5.95× 105 個(gè)／ml；從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，紅色為NC組，藍(lán)色為FITC?At18?HC組，測(cè)得FITC?At18?HC組陽(yáng)性細(xì)胞百分比為 91.3％，表明初次分離獲得原代肝細(xì)胞純度為91.3％ （見(jiàn)圖 ３）。

圖 ３ 分離肝細(xì)胞的純度測(cè)定

從操作流程來(lái)看，常規(guī)肝細(xì)胞提取主要采用膠原酶浸泡的方法消化組織。該方法雖然操作簡(jiǎn)單（無(wú)需灌注），但是浸泡消化的時(shí)間和強(qiáng)度不易掌握，得到的肝細(xì)胞質(zhì)量不好（活力一般低于80%），不能滿足有些實(shí)驗(yàn)的需求。因此本研究選擇了操作復(fù)雜但效果更好的酶灌注消化法。灌流在肝細(xì)胞提取中又是非常重要的環(huán)節(jié)，直接決定實(shí)驗(yàn)所獲取細(xì)胞的質(zhì)量。在實(shí)際操作中我們發(fā)現(xiàn)，小鼠門(mén)靜脈非常細(xì)小，不易穿刺。經(jīng)過(guò)多次摸索，我們?cè)趦刹焦嘞捶ǖ幕A(chǔ)上，優(yōu)化出一種更易操作的方法，即采用下腔靜脈進(jìn)、門(mén)靜脈出的方式。下腔靜脈相對(duì)門(mén)靜脈更粗，因此方便穿刺操作。該改良方法相對(duì)降低了實(shí)驗(yàn)的操作難度，降低了對(duì)實(shí)驗(yàn)材料的要求（常見(jiàn)的靜脈輸液針即可滿足需求）。同時(shí)經(jīng)改法獲得的肝細(xì)胞純度和活力均在90%以上，能夠滿足大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)需求。在實(shí)驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn)，該方法的主要不足之處在于灌流液體可從門(mén)靜脈流出，因而增大了細(xì)胞污染的幾率，故要求實(shí)驗(yàn)者在操作時(shí)應(yīng)小心謹(jǐn)慎。課題組在傳統(tǒng)肝細(xì)胞提取方法的基礎(chǔ)上，改變了灌流方式，得到了良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為從事相關(guān)研究者提供參考。同時(shí)，建立和完善肝細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)技術(shù)將為人工生物肝臟研究及其臨床應(yīng)用提供技術(shù)參考，具有重要意義。

原創(chuàng)單位：第三軍醫(yī)大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室