首次使用要加試劑:RNA wash buffer II 加48ml無(wú)水乙醇;RB buffer 每毫升加20μL2-mercaptoethanol (硫基乙醇)。
試劑使用順序:RB—RWF wash Buffer –RNA wash Buffer II---DEPC/ddH2O2(65℃預(yù)熱);提前開(kāi)水浴鍋65℃
1、100mg植物材料液氮研磨,加入到1.5ml 離心管;
2、迅速加入500μL RB buffer,旋渦震蕩至完全懸??;
3、吸取液體過(guò)柱(gDNA 藍(lán)),室溫離心14000r,5min;(去除gDNA)
4、加入0.5倍體積的無(wú)水乙醇(約250μL)于過(guò)柱液體,吸打混勻;
5、吸取700μL過(guò)柱(RNA橙色),室溫離心12000r,1min;
6、棄掉濾液,將剩余液體加入吸附柱,12000r,1min; (可重復(fù)步驟5.6過(guò)柱一次 吸附RNA)
7、加入400μL RWF,10000r離心1min;
8、棄掉廢液,加入500μL wash buffer II,10000 r離心30s;
9、棄掉廢液,加入500μL wash buffer II,10000 r離心30s;
10、換新管,12000r空離2min;室溫晾干(濾膜干了就行,不能太久,過(guò)干難洗脫),去除乙醇
11、將過(guò)濾柱轉(zhuǎn)移至新1.5ml離心管,加入65℃預(yù)熱的DEPC/ ddH2O2水50-100ul (分2次加,每次25ul洗脫RNA);,室溫2min;10000r離心2min
12、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量,分光光度計(jì)檢測(cè)濃度及OD值;RNA儲(chǔ)存在-80℃。