"KBM-5細胞：人慢性髓白血病細胞系
細胞背景資料：慢性髓白血病；女性
細胞形態(tài)：淋巴母細胞樣
細胞生長：懸浮
細胞物種來源：人源或鼠源等其它物種來源
細胞產品包裝：復蘇形式：T２５培養(yǎng)瓶(一瓶)或凍存形式：１ml凍存管(兩支)
細胞傳代方法：１：２-１：３傳代；每周換液２-３次。
細胞來源說明：細胞主要來源ATCC、DSMZ、ECACC、RIKEN、INCell、promocell、ScienCell、ECACC、JCRB、KCLB、Asterand、ICLC以及少數(shù)國外著名大學建系
細胞生長特性：懸浮
培養(yǎng)細胞的凍存及復蘇：細胞低溫凍存是培養(yǎng)室常規(guī)工作和通用技術。細胞凍存在-１９６℃液氮中，儲存時間幾乎是無限的。細胞凍存及復蘇的原則是慢凍快融?！緝龃婕毎浚?選對數(shù)增生期細胞(證明無支原體污染)，在凍存前１d換液；２)按常規(guī)方法把培養(yǎng)細胞制備成懸液，計數(shù)，使細胞密度達５×１０／ml左右密度，離心，去上清；３)加入配制好的凍存液(培養(yǎng)液６.８ml，小牛血清２ml，DMSO １ml，５.６%NaHCO３ ０.１ml)，按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細胞重懸。凍存細胞時培養(yǎng)液中加入保護劑１０％二甲基亞砜(DMSO)或甘油，可使冰點降低，使細胞內水分在凍結前透出細胞外；４)分裝于無菌凍存管中，每管加１.５m懸液；５)旋好凍存管并仔細檢查，一定要蓋緊，做好標記；６)凍存：在特殊的儀器或簡易的液氮容器中，按-１℃／min的速度，在３０～４０min時間內，下降到液氮表面，再停３０min后，直接投入液氮中。要適當掌握下降冷凍速度，過快能影響細胞內水分透出，太慢則促進冰晶形成。操作時應戴防護眼鏡和手套，以免液氮凍傷。【復蘇細胞】１)從罐中取出凍存管；２)迅速放入３６℃～３７℃水浴，不時搖動，使其急速融化，３０～６０s內完成；３)凍存管用７０％酒精擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管將細胞懸液注入離心管中，再滴加１０ml培養(yǎng)液；４)低速離心(５００～１０００r／min) ５min，去上清后再用培養(yǎng)液洗一次；５)用培養(yǎng)液適當稀釋后，裝入培養(yǎng)瓶３７℃培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液后，繼續(xù)培養(yǎng)。以后仍按常規(guī)進行培養(yǎng)。凍存細胞數(shù)量要充分，密度應達到１０／ml，在融后稀釋２０倍時，仍能保持５×１０／ml數(shù)量。
貼壁細胞凍存注意事項：細胞凍存液需提前配制，不可直接將DMSO加入細胞懸液中；不同細胞消化時間有差異，以實際鏡檢結果為準，大部分細胞回縮變圓并有少量細胞脫落即可中止消化，消化時間不宜過長；應選擇匯合度80%-90%左右，細胞處于對數(shù)生長期時進行凍存操作，確保細胞凍存時狀態(tài)，凍存密度可根據(jù)細胞特性進行調整；凍存細胞保存溫度應低于-130℃，不可在-80℃長期保存。貼壁細胞凍存操作步驟：從培養(yǎng)箱中取出準備凍存的細胞；顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)并拍照記錄；酒精消毒培養(yǎng)瓶后放入安全柜中；吸去多余的培養(yǎng)基，加人2~3ml(PBS緩沖液)潤洗一次；加入1ml胰酶，放入37℃消化；消化1min左右，在顯微鏡下觀察細胞消化情況；消化完全后，加3ml完全培養(yǎng)基終止；將細胞懸液移入15ml離心管中離心，1000rpm/min（約200g）離心3-5min；吸去多余的液體，向細胞沉淀中加入適量的凍存液，輕輕吸打混勻；按比例分裝至凍存管中；貼好標簽后放入梯度凍存盒中；將凍存盒放入-80℃，降溫過夜后，移入液氮中保存。貼壁細胞凍存實驗準備事項：將15mL離心管、凍存管、PBS緩沖液、移液管、電動移液器等物品提前放入生物安全柜中，紫外照射30min消毒滅菌；細胞完全培養(yǎng)基、0.25%胰酶-0.02%EDTA、細胞凍存液等從4℃冰箱中取出后，復溫至室溫，備用；程序降溫盒復溫至室溫備用。
細胞培養(yǎng)實驗相關問題總結：支原體(mycoplasma)污染的細胞，是否能以肉眼觀察出異狀？不能。除極有經驗之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨之；支原體污染會對細胞培養(yǎng)有何影響？支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數(shù)，代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果之數(shù)據(jù)方有意義；偵測出細胞株有支原體污染時，該如何處理？直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株；CO２培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之；為何培養(yǎng)基保存于４°C冰箱中，顏色會偏暗紅色，且pH值會越來越偏堿性？培養(yǎng)基保存于４°C冰箱中，培養(yǎng)基內之CO２會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenol red)的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結果，將造成細胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時，可以通入無菌過濾之CO２，以調整pH值；購買之細胞冷凍管經解凍后，為何會發(fā)生細胞數(shù)目太少之情形？研究人員在冷凍細胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細胞數(shù)目太少，大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細胞的物理性損傷，以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心，應待細胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可；購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？研究人員在細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細胞置于–８０°C太久；收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應立刻將冷凍管再一次扭緊。
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關鍵字： KBM-5細胞：人慢性髓白血病細胞系;
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