Mouse VEGF ELISA Kit

康朗生物的Mouse VEGF ELISA Kit (Mouse Vascular Endothelial Growth Factor Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Kit)，即小鼠血管內(nèi)皮生長因子酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，是一種用于特異性地高靈敏地定量檢測小鼠血清、血漿或細胞培養(yǎng)上清液中的VEGF的ELISA試劑盒。
本產(chǎn)品檢測靈敏度高，特異性強，重復(fù)性好。多次重復(fù)檢測結(jié)果表明，最小檢出量為6.7pg/ml，與人VEGF121、VEGF165、PLGF等均沒有交叉反應(yīng)，板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。
血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF或VEGF-A)，又稱血管通透因子(Vascular Permeability Factor, VPF)，是調(diào)控胎兒和成人血管生成的重要調(diào)節(jié)因子。VEGF屬于血小板源性生長因子(Platelet Derived Growth Factor, PDGF)家族，結(jié)構(gòu)上具有8個保守的半胱氨酸殘基，并通過二硫鍵形成反向平行的二聚體。小鼠體內(nèi)存在長度分別為120、164和188個氨基酸長度的VEGF異構(gòu)體，人體內(nèi)的VEGF主要有氨基酸長度分別為121、145、165、183、189和206這幾種亞型，其中VEGF₁₆₅在人體內(nèi)含量最多且活性最強，其次是VEGF₁₂₁和VEGF₁₈₉。小鼠VEGF₁₆₄與大鼠相應(yīng)的VEGF具有97%的氨基酸同源性，與人和豬的VEGF具有89%的氨基酸同源性，與牛VEGF具有88%氨基酸同源性，與貓、馬和犬VEGF具有90%的氨基酸同源性。VEGF在多種細胞和組織中均有表達，例如骨骼肌和心肌組織、肝細胞、成骨細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、角質(zhì)細胞、褐色脂肪組織、CD34⁺干細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和血管平滑肌細胞等。缺氧或在IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α等其他細胞因子刺激下，上述這些組織和細胞就會表達VEGF。。
VEGF主要參與血管生成過程。在胚胎形成時期，VEGF調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移和存活，從而調(diào)節(jié)血管密度，但并不能調(diào)節(jié)所形成血管的類型。通過招募成骨細胞和成軟骨細胞，VEGF還能促進骨生成，同時VEGF還是單核細胞的化學(xué)引誘物。在嬰兒體內(nèi)，VEGF能夠維持內(nèi)皮細胞完整性，同時還是血管內(nèi)皮細胞的促細胞分裂素。在成人體內(nèi)，VEGF主要在傷口恢復(fù)和女性的生殖周期中發(fā)揮作用。在病變組織中，VEGF能夠提高血管通透性，因此VEGF被認為能夠通過促進腫瘤部位血管新生從而促進腫瘤轉(zhuǎn)移。游離的VEGF水平被認為與部分自身免疫疾病狀況相關(guān)。
VEGF二聚體與兩個受體酪氨酸激酶結(jié)合，VEGF R1(Flt-1)和VEGF R2(Flk-1/KDR)，隨后誘導(dǎo)二者的同源二聚化和自身磷酸化。受體主要表達在血管內(nèi)皮細胞和一些非內(nèi)皮細胞上，盡管VEGF R1對VEGF的親和力更高，但VEGF R2才是VEGF發(fā)揮活性的主要調(diào)節(jié)受體。VEGF與受體結(jié)合后，能夠激活Ras/MAPK、FAK/paxillin及PI3K/AKT等信號通路調(diào)節(jié)細胞增殖、基因表達及血管通透性等。 
本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法(Sandwich ELISA)檢測樣品中小鼠VEGF的濃度，其原理見圖1。小鼠VEGF特異的單克隆捕獲抗體已預(yù)包被于酶標板上，當加入標準品或樣品時，其中的小鼠VEGF會與捕獲抗體結(jié)合。當加入生物素化的抗小鼠VEGF抗體后，生物素化抗小鼠VEGF抗體與小鼠VEGF結(jié)合，形成夾心的免疫復(fù)合物。隨后加入辣根過氧化物酶標記Streptavidin(HRP-Streptavidin)，由于生物素與鏈霉親和素(Streptavidin)可以特異性地結(jié)合，因此鏈霉親和素連接的HRP就會與夾心的免疫復(fù)合物連接起來而被固相捕獲。最后加入顯色劑TMB溶液，固相捕獲的辣根過氧化物酶就會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過酶標儀檢測450nm處的吸光度值就能實現(xiàn)定量檢測。小鼠VEGF濃度與A450值呈正比，通過繪制標準曲線，對照樣品吸光度值，即可計算出樣品中小鼠VEGF濃度。

圖1. 雙抗體夾心ELISA原理圖。

一個包裝的本試劑盒，包括標準品檢測，可以進行96次檢測。
保存條件：
      標準品4℃保存，1-2周內(nèi)有效，-20℃保存6個月內(nèi)有效；試劑盒其它組分4℃保存6個月內(nèi)有效。除標準品外，試劑盒其它組分嚴禁凍存。
注意事項：
      由于標準品一般是凍干粉，在制備后需要嚴格校準，所以標準品的瓶數(shù)及每瓶標準品所需加入的稀釋液體積請以實際收到的試劑盒及標準品標簽上的標注為準。
      洗滌液(20X)在低溫下可能有結(jié)晶，如果發(fā)現(xiàn)有結(jié)晶，請室溫水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。
      為保證標準品的精確性，標準品配制使用后，如果有剩余請勿再次使用。
      TMB溶液請勿接觸氧化劑和金屬，否則容易失效。
      加樣時，請注意每個樣品或標準品必須更換槍頭，一方面避免交叉污染，另一方面也避免吸取體積的誤差。
      由于本試劑盒均經(jīng)過獨立測試，所以請勿混用不同貨號和不同批次的試劑盒組分，即使是同種試劑盒不同批次的試劑盒組分也不能混用。多個試劑盒同時檢測時，請獨立使用各個試劑盒中的試劑，請勿使用不同試劑盒中相同名稱的組分。
      充分混勻?qū)ΡＷC反應(yīng)結(jié)果的精準性很重要，在加液后請輕輕晃動整個96孔板，以保證混勻。
      本試劑盒很多操作在室溫進行，要求嚴格控制室溫在25-28℃。溫度低于25℃會導(dǎo)致最終檢測到的吸光度顯著下降。
      洗滌過程非常重要，洗滌不充分會使精確度下降并導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。
      檢測標準品和樣品時建議設(shè)置重復(fù)孔，以確保檢測結(jié)果的可信度。
      加樣過程中須避免氣泡的產(chǎn)生。
      本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
 

使用說明：
1.樣品準備
a. 樣品的準備請按下列流程進行操作：
(a)細胞上清樣品離心取上清即可(如100-500g，5分鐘)。
(b)對于血清樣品，將全血在室溫下放置30分鐘至2小時，不要劇烈搖晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃約1000-2000g離心10分鐘，取黃色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黃色沉淀。制備好的血清需置于冰上待用。
(c)對于血漿樣品，采集的全血建議使用EDTA進行抗凝處理，混勻后置冰上，4℃約1000-2000g離心10分鐘，取黃色或淡黃色上清即得血漿，注意不要吸取白色沉淀。制備好的血漿需置于冰上待用。
(d)若待測樣品不能及時檢測，樣品制備后請分裝，凍存于-20℃或-80℃，并注意避免反復(fù)凍融。
b.血清樣品不應(yīng)添加任何防腐劑或抗凝劑。
c.樣品應(yīng)清澈透明，檢測前樣品中如有懸浮物應(yīng)通過離心去除。
d.請勿使用溶血、高血脂或污染的樣品檢測，否則結(jié)果將不準確。
注：血清或血漿樣品可能需要用樣品分析緩沖液適當稀釋后再檢測。
2.檢測前準備工作
a.試劑盒從冰箱中取出后應(yīng)置室溫(25-28℃)平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時置于4℃保存。
b.配制適當量的洗滌液：將洗滌液(20X)用雙蒸水或去離子水稀釋至1X，例如10ml洗滌液(20X)加190ml水混勻后即為1X的洗滌液。
c.按標準品標簽上標注的體積加入標準品稀釋液至1瓶標準品中，室溫孵育15分鐘(為確保標準曲線的準確性，切勿縮短孵育時間)。隨后輕輕混勻并用移液槍吹打幾次使標準品徹底溶解，使標準品終濃度達到1000pg/ml。通常每個濃度的標準品需要檢測2個孔，每個孔的標準品用量為100μl，共需200μl，同時稀釋時還需要使用250μl，因此如果1瓶標準品配制后的體積不足0.45ml，請使用更多瓶數(shù)的標準品，并在合并混勻后使用。
d.取5個潔凈的1.5毫升離心管，每管預(yù)先加入250μl的標準品稀釋液，并參考圖2進行標準品的倍比稀釋，最終得到1000、500、250、125、62.5、31.25pg/ml共六個標準品濃度，最后將稀釋好的標準品依次加入預(yù)包被板孔中，標準品稀釋液直接加入作為0pg/ml濃度，共七個標準品濃度。

 
圖2. 標準品倍比稀釋示意圖。按標準品(STANDARD)標簽上標注體積加入標準品稀釋液溶解并混勻后的濃度為標準品的起始濃度。其它的倍比稀釋后的濃度依次為起始濃度的1/2、1/4、1/8、1/16和1/32。

3.洗滌方法
自動洗板機或手工洗板：每孔洗滌液為300μl，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣在厚吸水紙上適當用力拍干。
4.實驗過程需自備的材料和儀器
a.不同規(guī)格的移液槍及相應(yīng)的吸頭
b.酶標儀
c.自動洗板機(如果沒有也可以手工洗板)
d.去離子水或雙蒸水
5.操作步驟
a.計算并確定一次實驗所需的預(yù)包被板條數(shù)，取出所需板條放置在96孔框架內(nèi)，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封，保存于4℃。
b.每次實驗都需配制標準品并繪制出標準曲線，同時建議設(shè)置本底較正孔，即空白孔，設(shè)置方法為該孔只加TMB溶液和終止液。
c.分別將樣品或不同濃度標準品按照100μl/孔加入相應(yīng)孔中，用封板膜(透明)封住反應(yīng)孔，室溫孵育120分鐘。對于血清或血漿樣品的VEGF的檢測，可以加入50μl樣品分析緩沖液后加50μl樣品；如稀釋比例大，將樣品與樣品分析緩沖液等量加入，不足部分用標準品稀釋液補充至100μl。請注意記錄好樣品的稀釋倍數(shù)。
注意：請先查閱相關(guān)文獻確定樣品中待檢測蛋白的大致濃度，如果該濃度大于或者小于本試劑盒的最高或者最低標準品濃度，請適當稀釋或濃縮后再進行檢測。
d.洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
e.加入生物素化抗體100μl/孔(注：此生物素化抗體已經(jīng)預(yù)先配制好，可以直接使用，不必再進行稀釋)。用封板膜(透明)封住反應(yīng)孔，室溫孵育60分鐘。
f.洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
g.加入辣根過氧化物酶標記Streptavidin 100μl/孔(注：此辣根過氧化物酶標記Streptavidin已經(jīng)預(yù)先配制好，可以直接使用，不必再進行稀釋)。用封板膜(白色)封住反應(yīng)孔，室溫避光孵育20分鐘。室溫偏低時(低于25℃)，需要適當延長孵育時間。
h.洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
i.加入顯色劑TMB溶液100μl/孔，用封板膜(白色)封住反應(yīng)孔，室溫避光孵育15-20分鐘。室溫偏低時需要適當延長孵育時間，此時可以孵育至標準品出現(xiàn)非常顯著的顏色變化，若樣本濃度足夠高也會出現(xiàn)顯著的顏色變化。
j.加入終止液50μl/孔，混勻后立即測量A450值。
6.結(jié)果分析
a.復(fù)孔的值通常在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效，復(fù)孔平均值可作為測量值。
b.每個標準品或樣品的吸光度值應(yīng)減去本底校正孔的吸光度值(如果沒有做校正孔，則不需要減去)。
c.繪制標準曲線。以標準品濃度為橫坐標，A450值為縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。通過樣品的吸光度值和標準曲線計算出樣品的相應(yīng)濃度。

圖3. Mouse VEGF ELISA Kit的標準曲線。實測數(shù)據(jù)會因?qū)嶒灄l件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。 
d.若樣品OD值高于標準曲線上限，應(yīng)適當稀釋后重新測定，計算濃度時需注意乘以樣品的稀釋倍數(shù)。

特別提示：本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！