Easy-Load™ PCR Master Mix (Green, 2X)

信裕生物的Easy-Load™ PCR Master Mix(Green, 2X)是一種使用特別便捷的含有藍色和橙色染料(電泳位置分別約4kb和50bp)的2倍濃度的PCR預混液，含有2X Taq DNA Polymerase、2X PCR Buffer、2X dNTP和2X Loading Buffer，只需加入模板DNA、引物和水即可進行PCR擴增，并且擴增完畢后可以直接上樣電泳。主要適用于cDNA或基因組DNA等的常規(guī)PCR擴增，特別適合于定性或半定量的PCR擴增，也可用于長度小于2kb的DNA片段的擴增和克隆。
Easy-Load™ PCR Master Mix(Green, 2X)中已經含有所有的通用組分，用戶只需自備引物、模板DNA和水即可進行PCR擴增。大大簡化了PCR操作，使操作更加快捷，也減少了PCR操作過程中可能導致的污染，使PCR的重復性更好。
Easy-Load™ PCR Master Mix(Green, 2X)可以擴增出長達8kb的片段，但通常更適合用于擴增2kb以下的DNA片段。
本產品中加入了藍色和橙色的電泳示蹤染料(整體呈現(xiàn)綠色)，其在濃度為1%瓊脂糖膠中的遷移位置分別大約位于4kb和50bp處。PCR結束后可直接進行電泳檢測，無需再添加上樣緩沖液。藍色和橙色示蹤染料不會影響對相應DNA條帶的觀察和檢測。
本產品穩(wěn)定性高，經測試，反復凍融15次后對PCR的擴增效果無顯著影響。反復凍融15次前后，使用不同引物擴增100-1500bp間不同長度目的片段的效果如圖1所示。

圖1. 本產品反復凍融15次前后擴增不同長度產物的效果圖。A. 反復凍融前本產品進行PCR的擴增結果。B.反復凍融15次后的本產品進行PCR的擴增結果。除本產品是否反復凍融15次外，A和B的反應體系完全相同，電泳的上樣量也相同。每毫升Easy-Load™ PCR Master Mix若用于50微升的PCR反應體系，足夠用于40個反應；若用于20微升的PCR反應體系，足夠用于100個反應。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存至少一年有效。適當避免反復凍融。如需頻繁使用，可取適量存放于4℃，至少3天內有效。
注意事項：
由于PCR反應非常靈敏，可使目的基因擴增超過1000萬倍，在設置PCR反應時請注意避免微量待擴增DNA的污染，并盡量考慮設置不加模板的空白對照以確認是否有待擴增DNA的污染。
Taq DNA polymerase在PCR過程中每個循環(huán)的出錯幾率約為2.2×10^-5，對于大于1kb的DNA片段的克隆推薦使用出錯幾率更低的DNA聚合酶，例如Pfu DNA polymerase、BeyoTaq DNA polymerase等。對于普通的PCR或RT-PCR進行定性或定量檢測，Taq DNA polymerase是選擇。
盡管本產品經過15次反復凍融后仍具有和凍融前幾乎相同的PCR擴增效果，但仍宜適當避免反復凍融本產品，多次反復凍融可能使產品性能下降。
使用本產品前，一定要完全融化，并上下顛倒輕輕混勻后才能使用，并盡量避免產生氣泡。
本產品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：

1. 1.PCR反應體系的設置：
   1. a.室溫融解Easy-Load™ PCR Master Mix (Green,2X)，上下顛倒輕輕混勻后低速離心數(shù)秒。
   2. b.參考下表在冰浴上設置PCR反應體系：
      ▼

      ▲

      試劑

      最終濃度

      體積

      體積

      雙蒸水或Milli-Q水

      -

      (21-x)μl

      (8.4-y)μl

      模板DNA

      10pg-1μg

      xμl

      yμl

      引物混合物(10μM)

      0.8μM

      4μl

      1.6μl

      Easy-Load™ PCR Master Mix (Green, 2X)

      1X

      25μl

      10μl

      總體積

      -

      50μl

      20μl
      • 注意：(a)通常引物的終濃度為0.2μM時可獲得良好的檢測效果，也可以根據情況在0.1-1.0μM范圍內調整引物的終濃度。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應時，可降低引物濃度。
      • (b) 對于不同類型的模板在50μl反應體積中推薦用量如下：
      • 哺乳動物基因組DNA：0.1-1μg；大腸桿菌基因組DNA：10-100ng；質粒DNA：0.1-10ng。過多的模板DNA容易導致非特異性的PCR產物。
   3. c.用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
   4. d.如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒有熱蓋，則在管內滴入一滴礦物油(mineral oil，ST275)。
   5. e.各設置好的PCR反應管置于PCR儀上，開始PCR反應。
2. 2.PCR反應參數(shù)的設置可以參考如下示例：
   • STEP1(起始變性): 94℃ 3min
   • STEP2(變性): 94℃ 30sec
   • STEP3(退火): 55℃ 30sec
   • STEP4(延伸): 72℃ 1min
   • STEP5(循環(huán)): Go To STEP2 for 30 cycles
   • STEP6(最終延伸): 72℃ 10min
   • STEP7(臨時保存): 4℃ forever
3. 注意：
   1. a.PCR反應的設置需根據模板、引物、PCR產物的長度和GC含量等條件的不同設定不同的PCR反應條件包括溫度、時間和循環(huán)數(shù)等。
   2. b.STEP4(延伸)的時間設置需根據PCR產物的長度進行設置，通常每kb產物的延伸時間為1分鐘。例如PCR產物的長度為1kb，則延伸時間可以設置為1分鐘，PCR產物的長度為2kb，則延伸時間可以設置為2分鐘，以此類推。
   3. c.對于初次進行的PCR，為盡量確保可以擴增出預期的PCR產物，可以把循環(huán)數(shù)設置為35。對于需進行半定量或定量的PCR反應循環(huán)數(shù)一定要進行適當優(yōu)化，使PCR反應沒有達到平臺期。
4. 3.結果檢測：PCR結束后直接取5-10μl進行電泳檢測，無需添加上樣緩沖液。

常見問題：

1. 1.PCR產物非常少或沒有特異性條帶。
   1. a.引物設計不佳是PCR過程中最常見的問題。請選擇適當?shù)囊镌O計軟件進行引物設計，注意引物的GC含量、二級結構、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在加入酶切位點等的引物中，一定要注意加入酶切位點等后整條引物的GC含量、二級結構、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在原有引物效果不佳的情況并且陽性對照引物可以正常工作的情況下，可以考慮更換引物。
   2. b.待擴增片段GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會變得相對比較困難，此時可以使用適合擴增高GC含量DNA片段的GC-rich buffer，并相應地根據GC-rich buffer的要求或說明調整PCR反應參數(shù)的設置。
   3. c.長片段擴增。盡管Taq DNA polymerase可以擴增最長達8kb的DNA片段，但大多數(shù)時候比較適合擴增2-3kb以下的片段，更長片段的擴增推薦使用其它更適合長片段擴增的DNA聚合酶。
   4. d.PCR反應設置時在室溫進行容易導致非特異性條件。推薦在冰浴上設置PCR反應。
   5. e.由于引物存在一定的二級結構或存在一定的引物二聚體，或引物偏短，導致退火效果不佳。此時可以采用Touch down等方法進行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55℃或50℃的方法，使退火更加充分。
   6. f.退火溫度不佳，需要優(yōu)化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設置退火的溫度梯度，摸索退火的溫度。如果沒有溫度梯度PCR儀，則可以通過多次PCR反應摸索的退火溫度。
   7. g.延伸時間不足?？砂凑彰?kb片段延伸1分鐘進行設置，對于較難擴增的片段可以設置為每1kb片段延伸1.5-2分鐘。
   8. h.待擴增片段GC含量較高或長度較長，變性不夠充分。可以調節(jié)起始變性條件至95℃ 1min甚至95℃ 2-4min。
   9. i.在不同PCR儀上進行PCR反應，避免有時PCR儀出現(xiàn)問題。
   10. j.循環(huán)數(shù)不足，適當延長PCR的循環(huán)數(shù)。通常循環(huán)數(shù)最高不必超過40，常用的循環(huán)數(shù)范圍為25-35。
   11. k.模板含量太低，適當加大模板量，或采用巢式PCR(nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即為在原先設計的PCR引物內側再設計一對PCR引物，然后對次PCR產物進行稀釋后再進行一次PCR擴增，這樣一方面可以起到擴增作用，同時也可以從次PCR產物中擴增出特異性條帶。二次PCR則為比較簡單地用原有引物對次PCR產物進行稀釋后再進行一次PCR擴增，可以起到擴增作用，但不能去除非特異性條帶。
   12. l.模板中含有抑制PCR反應的物質，可以用適當?shù)腄NA純化方法例如柱純化等純化模板DNA。
   13. m.當產生較多非特異性條帶時，可以適當提高退火溫度。
   14. n.注意設置適當?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ胀ǔ泻艽髱椭?/li>