2X PCR Master Mix

2X PCR Master Mix中含有2X Taq DNA Polymerase，2X PCR Buffer，2X dNTP，只需加入適量引物、模板和水即可進行PCR擴增。大大簡化了PCR操作，使操作更加快捷，也減少了PCR操作過程中可能導致的污染，使PCR的重復性更好。
利用2X PCR Master Mix可以進行各種常規(guī)的PCR擴增，特別適合用于定性和半定量的PCR擴增，以及2kb以下DNA片段的T載體克隆。
2X PCR Master Mix可以擴增出長達8kb的片段，但通常更適合用于擴增2kb以下的DNA片段。
本產(chǎn)品穩(wěn)定性高，經(jīng)測試，反復凍融15次后對PCR的擴增效果無顯著影響。
本試劑盒用于50微升的PCR反應體系，足夠用于160個反應；用于20微升的PCR反應體系，足夠用于400個反應。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，至少一年有效。
注意事項：
由于PCR反應非常靈敏可以擴增目的基因序列超過1000萬倍，在使用Taq酶時請注意避免微量待擴增DNA的污染，并盡量考慮設置不加模板的空白對照以確認是否有待擴增DNA的污染。
Taq DNA polymerase在PCR過程中每循環(huán)的出錯幾率約為2.2×10^-5，對于大于1kb的DNA片段的克隆推薦使用出錯幾率更低的DNA聚合酶，例如Pfu DNA polymerase、BeyoTaq DNA polymerase等。對于普通的PCR或RT-PCR定性檢測或定量檢測，Taq DNA polymerase是選擇。
盡管本產(chǎn)品經(jīng)過15次反復凍融后仍具有和凍融前幾乎相同的PCR擴增效果，但仍宜適當避免反復凍融本產(chǎn)品，多次反復凍融可能使產(chǎn)品性能下降。
使用本產(chǎn)品前，一定要完全融化，并上下顛倒輕輕混勻后才能使用，盡量避免起泡。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明：

1. 1.PCR反應體系的設置：
   1. a.融解并混勻PCR反應所需的各種溶液。將2X PCR Master Mix置于冰浴上或冰盒內(nèi)。
   2. b.參考下表在冰浴上設置PCR反應體系：
      ▼

      ▲

      試劑

      最終濃度

      體積

      體積

      雙蒸水或Milli-Q水

      -

      (21-x)μl

      (8.4-y)μl

      模板DNA

      10pg-1μg*

      xμl

      yμl

      引物混合物(10μM each)

      0.8μM

      4μl

      1.6μl

      2X PCR Master Mix

      1X

      25μl

      10μl

      總體積

      -

      50μl

      20μl
      • *對于不同類型的模板在50μl反應體積中推薦用量如下：
        哺乳動物基因組DNA：0.1-1μg；大腸桿菌基因組DNA：10-100ng；質(zhì)粒DNA：0.1-10ng。
        過多的模板DNA容易導致非特異性的PCR產(chǎn)物。
   3. c.用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
   4. d.如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒有熱蓋，則在管內(nèi)滴入一滴礦物油(mineral oil，ST275)。
   5. e.把設置好的PCR反應體系置于PCR儀上，開始PCR反應。
2. 2.PCR反應參數(shù)的設置可以參考如下示例：
   • STEP1(起始變性): 94℃ 3min
   • STEP2(變性): 94℃ 30sec
   • STEP3(退火): 55℃ 30sec
   • STEP4(延伸): 72℃ 1min
   • STEP5(循環(huán)): Go To STEP2 for 30 cycles
   • STEP6(最終延伸): 72℃ 10min
   • STEP7(臨時保存): 4℃ forever
3. 注意：
   1. a.PCR反應的設置需根據(jù)模板、引物、PCR產(chǎn)物的長度和GC含量等條件的不同設定不同的PCR反應條件包括溫度、時間和循環(huán)數(shù)等。
   2. b.STEP4(延伸)的時間設置需根據(jù)PCR產(chǎn)物的長度進行設置，通常每kb產(chǎn)物的延伸時間為1分鐘。例如PCR產(chǎn)物的長度為1kb，則延伸時間可以設置為1分鐘，PCR產(chǎn)物的長度為2kb，則延伸時間可以設置為2分鐘，以此類推。
   3. c.對于初次進行的PCR，為盡量確?？梢詳U增出預期的PCR產(chǎn)物，可以把循環(huán)數(shù)設置為35。對于需進行半定量或定量的PCR反應循環(huán)數(shù)一定要進行適當優(yōu)化，使PCR反應沒有達到平臺期。

常見問題：

1. 1.PCR產(chǎn)物非常少或沒有特異性條帶。
   1. a.引物設計不佳是PCR過程中最常見的問題。請選擇適當?shù)囊镌O計軟件進行引物設計，注意引物的GC含量、二級結構、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在加入酶切位點等的引物中，一定要注意加入酶切位點等后整條引物的GC含量、二級結構、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在原有引物效果不佳的情況并且陽性對照引物可以正常工作的情況下，可以考慮更換引物。
   2. b.待擴增片段GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會變得相對比較困難，此時可以使用適合擴增高GC含量DNA片段的GC-rich buffer，并相應地根據(jù)GC-rich buffer的要求或說明調(diào)整PCR反應參數(shù)的設置。
   3. c.長片段擴增。盡管Taq DNA polymerase可以擴增最長達8kb的DNA片段，但大多數(shù)時候比較適合擴增2-3kb以下的片段，更長片段的擴增推薦使用其它更適合長片段擴增的DNA聚合酶。
   4. d.PCR反應設置時在室溫進行容易導致非特異性條件。推薦在冰浴上設置PCR反應。
   5. e.由于引物存在一定的二級結構或存在一定的引物二聚體，或引物偏短，導致退火效果不佳。此時可以采用Touch down等方法進行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55℃或50℃的方法，使退火更加充分。
   6. f.退火溫度不佳，需要優(yōu)化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設置退火的溫度梯度，摸索退火的溫度。如果沒有溫度梯度PCR儀，則可以通過多次PCR反應摸索的退火溫度。
   7. g.延伸時間不足。可按照每1kb片段延伸1分鐘進行設置，對于較難擴增的片段可以設置為每1kb片段延伸1.5-2分鐘。
   8. h.待擴增片段GC含量較高或長度較長，變性不夠充分?？梢哉{(diào)節(jié)起始變性條件至95℃ 1min甚至95℃ 2-4min。
   9. i.在不同PCR儀上進行PCR反應，避免有時PCR儀出現(xiàn)問題。
   10. j.循環(huán)數(shù)不足，適當延長PCR的循環(huán)數(shù)。通常循環(huán)數(shù)最高不必超過40，常用的循環(huán)數(shù)范圍為25-35。
   11. k.模板含量太低，適當加大模板量，或采用巢式PCR(nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即為在原先設計的PCR引物內(nèi)側再設計一對PCR引物，然后對次PCR產(chǎn)物進行稀釋后再進行一次PCR擴增，這樣一方面可以起到擴增作用，同時也可以從次PCR產(chǎn)物中擴增出特異性條帶。二次PCR則為比較簡單地用原有引物對次PCR產(chǎn)物進行稀釋后再進行一次PCR擴增，可以起到擴增作用，但不能去除非特異性條帶。
   12. l.模板中含有抑制PCR反應的物質(zhì)，可以用適當?shù)腄NA純化方法例如柱純化等純化模板DNA。
   13. m.當產(chǎn)生較多非特異性條帶時，可以適當提高退火溫度。
   14. n.注意設置適當?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ胀ǔ泻艽髱椭?/li>