BeyoFusion™ Plus DNA Polymerase

生產(chǎn)的BeyoFusion™ Plus DNA Polymerase，是一種以嗜熱古細(xì)菌DNA聚合酶(hyperthermophilic archaeon
bPyrococcus-like DNA polymerase)為基礎(chǔ)通過(guò)突變等改造而獲得的超高性能DNA聚合酶，它具有擴(kuò)增速度快、保真度極高、擴(kuò)增片段可以輕松達(dá)到12kb等優(yōu)點(diǎn)。
BeyoFusion™ Plus DNA Polymerase擴(kuò)增速度極快，擴(kuò)增小于6kb的DNA片段時(shí)，延伸1kb只需要15秒(參考表1)。普通的DNA聚合酶延伸1kb通常需要1-2分鐘。BeyoFusion™ Plus DNA Polymerase由于其超快的擴(kuò)增速度，可以顯著縮短PCR擴(kuò)增所需的時(shí)間。
BeyoFusion™ Plus DNA Polymerase是一種高保真DNA聚合酶。BeyoFusion™ Plus DNA Polymerase不僅可以非常高效地催化5’至3’方向的依賴(lài)于DNA模板的脫氧核苷酸的聚合反應(yīng)，它同時(shí)還具有3’至5’的外切酶活性(proofreading activity)，它的錯(cuò)誤發(fā)生概率比Taq酶要低26倍，比pfu酶要約低3倍(參考表1)。
表1. BeyoFusion™ Plus DNA Polymerase的主要性能與Taq酶及同類(lèi)產(chǎn)品的比較。

BeyoFusion™ Plus DNA Polymerase的擴(kuò)增長(zhǎng)度長(zhǎng)，可以達(dá)到12kb。BeyoFusion™ Plus DNA Polymerase非常適合長(zhǎng)片段DNA的擴(kuò)增，擴(kuò)增出來(lái)的片段可以輕松達(dá)到12kb(參考圖1和表1)，更長(zhǎng)片段的擴(kuò)增效果未經(jīng)測(cè)試。BeyoFusion™ Plus DNA聚合酶可以輕松勝任具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的、非常長(zhǎng)的DNA片段的準(zhǔn)確擴(kuò)增，因此它是目的基因擴(kuò)增和克隆的理想選擇。圖1. BeyoFusion™ Plus DNA polymerase以λDNA為模板，PCR擴(kuò)增不同長(zhǎng)度(0.5-12kb)片段的的電泳圖。來(lái)源：BeyoFusion™ Plus DNA Polymerase通過(guò)大腸桿菌重組、表達(dá)、純化而獲得。
用途：高保真PCR (high fidelity PCR)、點(diǎn)突變、PCR克隆等。BeyoFusion™ Plus DNA polymerase擴(kuò)增出來(lái)的DNA片段為雙粘端(參考表1)，可以直接用于T載體克隆。
活性定義：One unit is defined as the amount of enzyme that will incorporate 10 nmol of dNTP into acid
insoluble material in 30 minutes at 74°C。
純度：不含DNA內(nèi)切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含RNA酶，滿(mǎn)足常規(guī)PCR反應(yīng)要求。
酶儲(chǔ)存溶液：20mM Tris-HCl (pH 7.5), 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 100mM KCl, 200μg/ml BSA and 50% (v/v)
glycerol。
失活或抑制：酚氯仿抽提可以使BeyoFusion™ Plus DNA Polymerase失活。 
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存。
注意事項(xiàng)：
PCR反應(yīng)非常靈敏，在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)請(qǐng)注意避免微量待擴(kuò)增DNA的污染，并盡量考慮設(shè)置不加模板的空白對(duì)照。
本產(chǎn)品僅限于專(zhuān)業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說(shuō)明：

1. 1.PCR反應(yīng)體系的設(shè)置：
   1. a.溶解并混勻PCR反應(yīng)所需的各種溶液。將BeyoFusion™ Plus DNA Polymerase置于冰浴上或冰盒內(nèi)。
   2. b.參考下表在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)(如果有多個(gè)類(lèi)似的PCR反應(yīng)，可以先配制大體積的包含水、buffer、dNTP和BeyoFusion™ Plus DNA Polymerase的混合物，然后分裝到各PCR反應(yīng)管內(nèi)。根據(jù)情況，有時(shí)混合物中可以包括引物)：
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      擴(kuò)增片段小于6kb

      擴(kuò)增片段大于6kb

      試劑

      最終濃度

      體積

      最終濃度

      體積

      雙蒸水或Milli-Q水

      -

      (36.5-x)μl

      -

      (29-y)μl

      10X BeyoFusion™ Buffer
      (with Mg²⁺)

      1X

      5μl

      1X

      5μl

      dNTP (2.5mM each)

      0.25mM each

      5μl

      0.5mM each

      10μl

      模板DNA

      10pg-1μg*

      xμl

      10pg-1μg*

      yμl

      引物混合物(10μM each)

      0.2μM each

      1μl

      0.4μM each

      2μl

      BeyoFusion™ Plus DNA Polymerase

      2.5U/50μl

      1μl

      2.5U/50μl

      1μl

      總體積

      -

      50μl

      -

      50μl
      • *對(duì)于不同類(lèi)型的模板在50μl反應(yīng)體積中推薦用量如下：哺乳動(dòng)物基因組DNA：100ng；大腸桿菌基因組DNA：100ng；質(zhì)粒DNA：5-30ng。擴(kuò)增大于6kb的片段時(shí)，模板量宜適當(dāng)加大，但過(guò)多的模板DNA也容易導(dǎo)致非特異性的PCR產(chǎn)物。
      • 注意：參考上表，在擴(kuò)增大于6kb的片段時(shí)dNTP和引物的用量比擴(kuò)增小于6kb片段時(shí)加倍。
   3. c.用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
   4. d.如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒(méi)有熱蓋，則在管內(nèi)滴入一滴礦物油(mineral oil, ST275)。
   5. e.各設(shè)置好的PCR反應(yīng)管置于PCR儀上，開(kāi)始PCR反應(yīng)。
2. 2.PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置可以參考如下表格：
   ▼

   ▲

   PCR步驟

   擴(kuò)增片段小于6kb時(shí)

   擴(kuò)增片段大于6kb時(shí)

   STEP1(起始變性)

   92℃ 3min

   92℃ 3min

   STEP2(變性)

   92℃ 30sec

   92℃ 30sec

   STEP3(退火)

   55℃ 30sec

   55℃ 30sec

   STEP4(延伸)

   68℃ 15s/kb

   68℃ 1min/kb

   STEP5(循環(huán))

   Go To STEP2 for 30 cycles

   Go To STEP2 for 30 cycles

   STEP6(最終延伸)

   68℃ 10min

   68℃ 15min

   STEP7(臨時(shí)保存)

   4℃ forever

   4℃ forever
   1. a.起始變性和變性的溫度設(shè)置為94℃，延伸溫度設(shè)置為72℃，其余條件不變時(shí)，都可以進(jìn)行正常的PCR擴(kuò)增，但擴(kuò)增效果會(huì)稍有下降。對(duì)于較難擴(kuò)增的序列，推薦使用92℃變性和72℃延長(zhǎng)。
   2. b.PCR反應(yīng)的設(shè)置需根據(jù)模板、引物、PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度和GC含量等條件的不同設(shè)定不同的溫度、時(shí)間和循環(huán)數(shù)等。
   3. c.STEP4(延伸)的時(shí)間設(shè)置需根據(jù)PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度進(jìn)行設(shè)置，對(duì)于本產(chǎn)品擴(kuò)增小于6kb的DNA片段時(shí)，推薦每kb產(chǎn)物的延伸時(shí)間為15秒。例如PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度為1kb，則延伸時(shí)間可以設(shè)置為15秒，PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度為2kb，則延伸時(shí)間可以設(shè)置為30秒，以此類(lèi)推。擴(kuò)增大于6kb的DNA片段時(shí)，推薦每kb產(chǎn)物的延伸時(shí)間為1分鐘。例如PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度為10kb，則延伸時(shí)間可以設(shè)置為10分鐘，PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度為12kb，則延伸時(shí)間可以設(shè)置為12分鐘，以此類(lèi)推。
   4. d.對(duì)于初次進(jìn)行的PCR，為盡量確?？梢詳U(kuò)增出預(yù)期的PCR產(chǎn)物，可以把循環(huán)數(shù)設(shè)置為35。對(duì)于需進(jìn)行半定量或定量的PCR反應(yīng)，循環(huán)數(shù)一定要進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，使PCR反應(yīng)沒(méi)有達(dá)到平臺(tái)期。

常見(jiàn)問(wèn)題：

1. 1.PCR產(chǎn)物非常少或沒(méi)有特異性條帶。
   1. a.引物設(shè)計(jì)不佳是PCR過(guò)程中最常見(jiàn)的問(wèn)題。請(qǐng)選擇適當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，注意引物的GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長(zhǎng)度、特異性等方面的問(wèn)題。在加入酶切位點(diǎn)等的引物中，一定要注意加入酶切位點(diǎn)等后整條引物的GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長(zhǎng)度、特異性等方面的問(wèn)題。在原有引物效果不佳的情況并且陽(yáng)性對(duì)照引物可以正常工作的情況下，可以考慮更換引物。
   2. b.待擴(kuò)增片段GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會(huì)變得相對(duì)比較困難，此時(shí)可以使用適合擴(kuò)增高GC含量DNA片段的GC-rich buffer，并相應(yīng)地根據(jù)GC-rich buffer的要求或說(shuō)明調(diào)整PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置。直接添加1-10%DMSO或5-20%甘油對(duì)于擴(kuò)增高GC含量的片段也有幫助。
   3. c.PCR反應(yīng)設(shè)置時(shí)在室溫進(jìn)行容易導(dǎo)致非特異性條件。推薦在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)。
   4. d.由于引物存在一定的二級(jí)結(jié)構(gòu)或存在一定的引物二聚體，或引物偏短，導(dǎo)致退火效果不佳。此時(shí)可以采用Touch down等方法進(jìn)行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55℃或50℃的方法，使退火更加充分。
   5. e.退火溫度不佳，需要優(yōu)化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設(shè)置退火的溫度梯度，摸索退火的溫度。如果沒(méi)有溫度梯度PCR儀，則可以通過(guò)多次PCR反應(yīng)摸索的退火溫度。
   6. f.延伸時(shí)間不足?？梢栽谕扑]的延伸時(shí)間基礎(chǔ)上把延伸時(shí)間延長(zhǎng)2-5倍，對(duì)于較難擴(kuò)增的片段可以設(shè)置為每1kb延伸5分鐘。
   7. g.待擴(kuò)增片段GC含量較高或長(zhǎng)度較長(zhǎng)，變性不夠充分。可以調(diào)節(jié)起始變性條件至95℃ 1min甚至95℃ 2-4min。
   8. h.在不同PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，避免有時(shí)PCR儀出現(xiàn)問(wèn)題。
   9. i.循環(huán)數(shù)不足，適當(dāng)延長(zhǎng)PCR的循環(huán)數(shù)。通常循環(huán)數(shù)最高不必超過(guò)40，常用的循環(huán)數(shù)范圍為25-35。
   10. j.模板含量太低，適當(dāng)加大模板量，或采用巢式PCR(nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即為在原先設(shè)計(jì)的PCR引物內(nèi)側(cè)再設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，然后對(duì)次PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，這樣一方面可以起到擴(kuò)增作用，同時(shí)也可以從次PCR產(chǎn)物中擴(kuò)增出特異性條帶。二次PCR則為比較簡(jiǎn)單地用原有引物對(duì)次PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，可以起到擴(kuò)增作用，但不能去除非特異性條帶。
   11. k.模板中含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，可以用適當(dāng)?shù)腄NA純化方法例如柱純化等純化模板DNA。
   12. l.對(duì)PCR引物進(jìn)行脫鹽純化。
   13. m.使用高質(zhì)量的dNTP混合物。
   14. n.適當(dāng)增加DNA polymerase的用量。
   15. o.當(dāng)產(chǎn)生較多非特異性條帶時(shí)，可以適當(dāng)提高退火溫度。
   16. p.注意設(shè)置適當(dāng)?shù)年?yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照通常會(huì)有很大幫助。
2. 2.雜帶較多或條帶彌散。
   1. a.退火溫度提高2-5°C。
   2. b.減少DNA模板的用量。
   3. c.PCR反應(yīng)設(shè)置時(shí)在室溫進(jìn)行容易產(chǎn)生非特異性條帶。推薦在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)。
   4. d.適當(dāng)減少BeyoFusion™ Plus DNA Polymerase用量。
   5. e.適當(dāng)縮短延伸時(shí)間。