BeyoAmp™ Plus Extra-long DNA Polymerase

信裕生物生產(chǎn)的BeyoAmp™ Plus Extra-long DNA Polymerase，是一種通過基因重組改造而獲得的具有超強(qiáng)(4kb/min)、超長(zhǎng)(35kb)擴(kuò)增能力的高度熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，具有擴(kuò)增速度極快，保真度極高，短時(shí)間內(nèi)即可輕松實(shí)現(xiàn)35kb λDNA片段擴(kuò)增等突出優(yōu)點(diǎn)(參考圖1)。推薦用于5kb甚至30kb以上長(zhǎng)片段的PCR擴(kuò)增。
BeyoAmp™ Plus Extra-long DNA Polymerase使用單體酶完成超長(zhǎng)片段擴(kuò)增。同類產(chǎn)品如NEB的LongAmp^® Taq DNA Polymerase、Thermo的Scientific Extensor Long Range PCR Enzyme Mix、Promega的GoTaq^® Long PCR Master Mix等進(jìn)行超長(zhǎng)片段擴(kuò)增大多采用雙酶體系，即結(jié)合具有強(qiáng)擴(kuò)增能力的DNA聚合酶和具有校對(duì)功能的DNA聚合酶來實(shí)現(xiàn)保真性高的長(zhǎng)片段擴(kuò)增，而BeyoAmp™ Plus Extra-long DNA Polymerase和Thermo的GeneAmp^® XL PCR Kit中使用的rTth DNA Polymerase XL (Extra Long)類似，不需要任何其它酶或者蛋白、多肽等輔助因子，即可突破單體酶一步完成長(zhǎng)片段的擴(kuò)增。
BeyoAmp™ Plus Extra-long DNA Polymerase擴(kuò)增速度極快。擴(kuò)增小于6kb的DNA片段時(shí)，延伸每1kb只需要15秒；擴(kuò)增大于6kb的DNA片段時(shí)，延伸每1kb也只需要30秒。BeyoAmp™ Plus Extra-long DNA Polymerase由于其超快的擴(kuò)增速度，因而可以大大縮短超長(zhǎng)片段每個(gè)PCR循環(huán)的擴(kuò)增時(shí)間。本產(chǎn)品也同樣適用于短片段的擴(kuò)增，可以實(shí)現(xiàn)超快速的PCR擴(kuò)增。
BeyoAmp™ Plus Extra-long DNA Polymerase是一種高保真DNA聚合酶。它不僅可以非常高效地催化5'至3'方向的依賴于DNA模板的脫氧核苷酸的聚合反應(yīng)，它同時(shí)還具有3'至5'的外切酶活性(proofreading activity)，它的錯(cuò)誤發(fā)生概率比Taq酶要低10倍，比pfu酶的保真性還要略高一些。它可以輕松勝任具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的、非常長(zhǎng)的DNA片段的準(zhǔn)確擴(kuò)增，因此它是目的基因擴(kuò)增和克隆的理想選擇。
圖1. BeyoAmp™ Plus Extra-long DNA polymerase以λDNA為模板，PCR擴(kuò)增不同長(zhǎng)度片段(5-35kb)的電泳圖。電泳采用0.8%瓊脂糖凝膠，1XTAE，100V電泳180分鐘。
BeyoAmp™ Plus Extra-long DNA Polymerase的主要性能與Taq酶及同類產(chǎn)品的比較請(qǐng)參考下表。

來源：BeyoAmp™ Plus Extra-long DNA Polymerase通過大腸桿菌重組、表達(dá)、純化而獲得。
用途：超長(zhǎng)DNA片段的準(zhǔn)確高效PCR擴(kuò)增、常規(guī)高保真PCR、點(diǎn)突變、克隆用途的PCR擴(kuò)增等。BeyoAmp™ Plus Extra-long DNA polymerase擴(kuò)增出來的DNA片段為帶A的粘端，可以直接用于常規(guī)的T載體克隆。
活性定義：One unit is defined as the amount of enzyme that will incorporate 10 nmol of dNTP into acid insoluble material in 30 minutes at 74℃.
純度：不含DNA內(nèi)切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含RNA酶，滿足常規(guī)PCR反應(yīng)要求。
酶儲(chǔ)存溶液：20mM Tris-HCl (pH 7.5), 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 100mM KCl, 200µg/ml BSA and 50% (v/v) glycerol。
失活或抑制：酚抽提可以使BeyoAmp™ Plus Extra-long DNA polymerase失活。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存。
注意事項(xiàng)：
PCR反應(yīng)非常靈敏，在使用BeyoAmp™ Plus Extra-long DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)請(qǐng)注意避免微量待擴(kuò)增DNA的污染，并盡量設(shè)置不加模板的空白對(duì)照。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
 

使用說明：
1.PCR反應(yīng)體系的設(shè)置：
a.溶解并混勻PCR反應(yīng)所需的各種溶液。將BeyoAmp™ Plus Extra-long DNA polymerase置于冰浴上或冰盒內(nèi)。
b.參考下表在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)(如果有多個(gè)類似的PCR反應(yīng)，可以先配制大體積的包含水、buffer、dNTP和BeyoAmp™ Plus Extra-long DNA polymerase的混合物，然后分裝到各PCR反應(yīng)管內(nèi)。根據(jù)情況，有時(shí)混合物中可以包括引物)：

*對(duì)于不同類型模板DNA的推薦用量如下：哺乳動(dòng)物基因組DNA 100ng-500ng；大腸桿菌基因組DNA 100pg-100ng；質(zhì)粒DNA 1ng-20ng。擴(kuò)增大于25kb的片段時(shí)，模板量宜適當(dāng)加大，但過多的模板DNA也容易導(dǎo)致非特異性的PCR產(chǎn)物。
c.用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
d.如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果用的PCR儀沒有熱蓋，則在管內(nèi)滴入一滴礦物油(ST275 Mineral oil (礦物油))以防止蒸發(fā)。
e.各設(shè)置好的PCR反應(yīng)管置于PCR儀上，開始PCR反應(yīng)。
2.PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置可以參考如下表格：

說明：上面表格中15sec/kb表示，如果擴(kuò)增片段是4kb，那么68℃的延伸時(shí)間為1分鐘。0.5min/kb表示如果擴(kuò)增片段是4kb，那么68℃的延伸時(shí)間為2分鐘。*對(duì)于大于25kb的長(zhǎng)片段PCR，建議采用兩步法，將退火/延伸溫度合并為68℃，可顯著提高擴(kuò)增特異性。
a.最初變性和變性的溫度設(shè)置為94℃，延伸溫度設(shè)置為72℃，其余條件不變時(shí)，都可以進(jìn)行正常的PCR擴(kuò)增，但擴(kuò)增效果會(huì)稍有下降。對(duì)于較難擴(kuò)增的序列，推薦使用92℃變性和72℃延長(zhǎng)。
b.PCR反應(yīng)的設(shè)置需根據(jù)模板、引物、PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度和GC含量等條件的不同設(shè)定不同的變性、退火和延伸的溫度和時(shí)間以及循環(huán)數(shù)等。
c.對(duì)于初次進(jìn)行的PCR，為盡量確?？梢詳U(kuò)增出預(yù)期的PCR產(chǎn)物，可以把循環(huán)數(shù)設(shè)置為35。對(duì)于需進(jìn)行半定量或定量的PCR反應(yīng)，循環(huán)數(shù)需要進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，使PCR反應(yīng)沒有達(dá)到平臺(tái)期。

常見問題：
1.PCR產(chǎn)物非常少或沒有特異性條帶。
a.引物設(shè)計(jì)不佳是PCR過程中最常見的問題。請(qǐng)選擇適當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，注意引物的GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長(zhǎng)度、特異性等方面的問題。在加入酶切位點(diǎn)等的引物中，一定要注意加入酶切位點(diǎn)等后整條引物的GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長(zhǎng)度、特異性等方面的問題。在原有引物效果不佳的情況并且陽(yáng)性對(duì)照引物可以正常工作的情況下，可以考慮更換引物。
b.待擴(kuò)增片斷GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會(huì)變得相對(duì)比較困難，此時(shí)可以使用適合擴(kuò)增高GC含量DNA片斷的GC-rich buffer，并相應(yīng)地根據(jù)GC-rich buffer的要求或說明調(diào)整PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置。直接添加1-10%DMSO或5-20%甘油對(duì)于擴(kuò)增高GC含量的片段也有幫助。
c.PCR反應(yīng)設(shè)置時(shí)在室溫進(jìn)行容易導(dǎo)致非特異性條件。推薦在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)。
d.由于引物存在一定的二級(jí)結(jié)構(gòu)或存在一定的引物二聚體，或引物偏短，導(dǎo)致退火效果不佳。此時(shí)可以采用Touch down等方法進(jìn)行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55或50℃的方法，使退火更加充分。
e.退火溫度不佳，需要優(yōu)化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設(shè)置退火的溫度梯度，摸索退火的溫度。如果沒有溫度梯度PCR儀，則可以通過多次PCR反應(yīng)摸索的退火溫度。
f.延伸時(shí)間不足。可以在推薦的延伸時(shí)間基礎(chǔ)上把延伸時(shí)間延長(zhǎng)2-5倍，對(duì)于較難擴(kuò)增的片斷可以設(shè)置為每1kb延伸1分鐘。
g.待擴(kuò)增片斷GC含量較高或長(zhǎng)度較長(zhǎng)，變性不夠充分?？梢哉{(diào)節(jié)起始變性條件至94℃ 2-4min甚至94℃ 5min。
h.在不同PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，避免有時(shí)PCR儀出現(xiàn)問題。
i.循環(huán)數(shù)不足，適當(dāng)延長(zhǎng)PCR的循環(huán)數(shù)。通常循環(huán)數(shù)最高不必超過40，常用的循環(huán)數(shù)范圍為25-35。
j.模板含量太低，適當(dāng)加大模板量，或采用巢式PCR(nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即為在原先設(shè)計(jì)的PCR引物內(nèi)側(cè)再設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，然后對(duì)次PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，這樣一方面可以起到擴(kuò)增作用，同時(shí)也可以從次PCR產(chǎn)物中擴(kuò)增出特異性條帶。二次PCR則為比較簡(jiǎn)單地用原有引物對(duì)次PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，可以起到擴(kuò)增作用，但不能去除非特異性條帶。
k.模板中含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，可以用適當(dāng)?shù)腄NA純化方法例如柱純化等純化模板DNA。
l.對(duì)PCR引物進(jìn)行脫鹽純化。
m.使用高質(zhì)量的dNTP混合物。
n.適當(dāng)增加DNA polymerase的用量。
o.當(dāng)產(chǎn)生較多非特異性條帶時(shí)，可以適當(dāng)提高退火溫度。
p.注意設(shè)置適當(dāng)?shù)年?yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照通常會(huì)有很大幫助。
q.使用完整、高純度、高質(zhì)量的DNA模板，且避免模板反復(fù)凍融。長(zhǎng)片段DNA反復(fù)凍融過程中可能會(huì)出現(xiàn)斷裂的問題。
r.Mg²⁺濃度較低，或Mg²⁺與dNTP的比例不合適。使用本產(chǎn)品中提供的緩沖液就無(wú)需擔(dān)心鎂離子濃度的問題。
s.根據(jù)片段大小選擇合適的瓊脂糖凝膠濃度和電泳條件。大片段DNA的電泳需要使用低濃度的瓊脂糖凝膠和較低的電泳電壓，并電泳較長(zhǎng)的電泳時(shí)間。
t.PCR反應(yīng)體系中有氣泡或者溶液蒸發(fā)。
2.雜帶較多或條帶彌散
a.退火溫度提高2-5℃。
b.減少DNA模板的用量。
c.PCR反應(yīng)設(shè)置時(shí)在室溫進(jìn)行容易產(chǎn)生非特異性條帶。推薦在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)。
d.適當(dāng)減少BeyoAmp™ Plus Extra-long DNA Polymerase的用量。
e.適當(dāng)縮短延伸時(shí)間。