Seamless Cloning Kit (無縫克隆試劑盒)

信裕生物生產(chǎn)的Seamless Cloning Kit(無縫克隆試劑盒)是一種新型的基于插入片段和線性化載體的末端進(jìn)行同源重組的基因克隆試劑盒。本試劑盒利用包含了DNA 5' 外切酶(5' Exonuclease)、DNA聚合酶(DNA Polymerase)和DNA連接酶(DNA
Ligase)活性的重組酶(assembly enzyme)，通過同源重組的方法可以將一個或多個DNA片段按照預(yù)定方向、快速、高效和精確
地插入到線性化載體中，并且最終構(gòu)建的克隆沒有任何額外的堿基序列，因此被稱作“無縫克隆”。
和傳統(tǒng)的基因克隆方法相比，本試劑盒的無縫克隆方法有多方面的突出優(yōu)點(diǎn)：(1) 最終構(gòu)建的克隆沒有任何額外的堿基序列，因此是真正的"無縫克隆"；(2) 可通過一個反應(yīng)將一個或多個片段快速、定向地插入到載體的任何位置；(3) 待插入的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物無須酶切；(4) 插入片段的大小范圍寬，從20bp左右的小片段到10kb左右的大片段都可以成功插入；(5) 可通過PCR擴(kuò)增獲得線性化載體，因此限制性內(nèi)切酶消化并不是克隆所必須的；(6) 酶催化的重組連接反應(yīng)非?？焖俸透咝В瑢τ谝粋€片段的插入僅需50℃處理15分鐘；對于三個片段的插入僅需50℃處理30分鐘，而對于5個片段的插入也僅需50℃處理約60分鐘；(7) 只有插入片段和線性化載體的末端才能發(fā)生同源重組，可以有效避免非特異性的同源重組；(8) 陽性克隆比例高，單個DNA片段克隆的陽性率幾乎為100%，三個片段的克隆陽性率約為70-80%。
本無縫克隆試劑盒操作非常簡單。本試劑盒進(jìn)行基因克隆時沒有酶切位點(diǎn)的限制，僅需在載體的預(yù)定克隆位點(diǎn)通過酶切進(jìn)行線性化或通過PCR的方法直接制備線性化的載體，在插入片段的兩個PCR引物的5' 端引入與載體克隆位點(diǎn)兩端完全一致的
15~25bp的重疊序列。重組反應(yīng)可以在50℃快速進(jìn)行，3-4小時內(nèi)即可完成從DNA樣品的PCR擴(kuò)增、純化、重組、到轉(zhuǎn)化涂板的全部操作。其中PCR反應(yīng)約2-3小時，PCR產(chǎn)物純化約20分鐘，重組反應(yīng)15分鐘，轉(zhuǎn)化涂板約40分鐘，共計(jì)約3-4小時即可完成。
信裕生物無縫克隆試劑盒的工作原理示意圖請參考圖1。

圖1. 信裕生物無縫克隆試劑盒的工作原理圖。重疊區(qū)域(overlap region)的DNA序列完全一致，通常長度為15-25bp。不同顏
色的重疊區(qū)域代表不同的重疊序列。在插入2個或以上片段時，不同的重疊序列可以確保待插入片段有序地插入到線性化的載體(linearized vector)中。
本試劑盒中提供的linearized pUC18為通過EcoRI和BamHI雙酶切制備。為檢測本試劑盒的連接效率，試劑盒還提供了一個1100bp的DNA fragment, 通過使用pUC18的通用測序引物(M13 forward sequencing primer (5´-GTAAAACGACGGCCAGT-3´)和M13 reverse sequencing primer (5´-CAGGAAACAGCTATGAC-3´))可對連接轉(zhuǎn)化后的克隆進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后得到1300bp的片段的克隆則為陽性克隆，而擴(kuò)增后得到200bp的片段的克隆則為陰性克隆。
本試劑盒用于一個1100bp片段的克隆和三個不同的1100bp片段的克隆，其重組反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后涂板獲得的LB平板的實(shí)測效果參考圖2A，菌落PCR鑒定結(jié)果參考圖2B。

圖2. 本試劑盒用于無縫克隆的實(shí)測效果。A. 本試劑盒反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α后涂板獲得的LB平板效果圖。在20μl反應(yīng)體系中，將EcoRI和BamHI雙酶切線性化的載體pUC18 (Linearized pUC18)，與通過PCR擴(kuò)增的含有重疊序列的插入片段(DNA fragment, 1100bp)混合(pUC18載體與PCR片段的摩爾比為1:3)；或者與3個有適當(dāng)重疊序列的不同的1100bp片段混合，pUC18載體與PCR片段的摩爾比為1:1:1:1，然后加入10μl的2X Seamless Cloning Mix，并用水補(bǔ)至20μl，50℃反應(yīng)15min(插入一個片段)或30min(插入三個片段)。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物放置在冰上5min，取5μl轉(zhuǎn)化到100μl的DH5α感受態(tài)細(xì)菌中。對照組中只加入線性化的載體pUC18，同時也在50℃反應(yīng)15min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，插入片段數(shù)目越多轉(zhuǎn)化后得到的克隆數(shù)越少。B.菌落PCR鑒定用本試劑盒構(gòu)建得到的克隆。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，插入1個片段時的陽性率基本上為100%，插入3個片段時的陽性率約為70%左右。菌落PCR使用的是pUC18的通用測序引物M13 forward sequencing primer (5´-GTAAAACGACGGCCAGT-3´)和M13 reverse sequencing primer (5´-CAGGAAACAGCTATGAC-3´)。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，一年有效。
注意事項(xiàng)：
單個片段的PCR產(chǎn)物進(jìn)行重組反應(yīng)時，如果PCR條帶單一，可以無須純化并直接進(jìn)行重組反應(yīng)，但PCR產(chǎn)物的體積不得超過重組反應(yīng)體系的20%，并且重組效率通常會低于純化后的PCR產(chǎn)物。
對于多個片段的重組反應(yīng)，重組效率通常會低于單個片段的重組效率，建議膠回收純化后再進(jìn)行重組反應(yīng)。對于3個以上片段的重組反應(yīng)或重組片段大于5kb時，強(qiáng)烈建議在膠回收后再進(jìn)行重組反應(yīng)。通常膠回收后，重組效率可提高2-10倍。
單片段和線性化載體重組時，摩爾比至少為2:1。多片段和線性化載體重組時，各個片段和線性化載體的摩爾數(shù)宜保持一致。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
 

使用說明：
1. 線性化載體的制備
載體的線性化可以在目標(biāo)載體上選擇合適的位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切或單酶切，并對酶切后的載體進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和切膠純化(例如信裕生物的D0056, DNA凝膠回收試劑盒)。也可通過在質(zhì)粒插入位點(diǎn)的左右兩側(cè)設(shè)計(jì)方向相反的引物進(jìn)行PCR，以獲取線性化載體。PCR擴(kuò)增獲得的線性化載體，也需要瓊脂糖凝膠電泳和切膠純化。同時需要注意如下事項(xiàng)：
a. 為了降低載體自連背景，提高陽性率，建議采用雙酶切的方法對載體進(jìn)行線性化。載體單酶切容易造成載體切割不完全和自連，導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生。
b. 酶切后無論是5' 端突出、3' 端突出還是平末端都可以用于本試劑盒，但由于重組過程中會產(chǎn)生3' 端突出末端，因此酶切后
形成3' 端突出或平末端的假陽性率會更低一些。
c. 通過酶切獲得線性化載體的情況，線性化載體上的重疊序列只能用酶切后的3' 端序列進(jìn)行計(jì)算。特別是對于酶切后產(chǎn)生5' 端突出的情況，不能以5' 端突出部分計(jì)算重疊序列，因?yàn)橹亟M反應(yīng)時有DNA 5' 外切酶(5' Exonuclease)活性，會消化掉5' 端序列。
d. 酶切較長時間，例如酶切3小時以上或酶切過夜，可有效降低載體未切開或自連導(dǎo)致的背景。
e. 通過PCR方法獲得線性化載體時，建議在PCR后使用DpnI (例如信裕生物的D6257)進(jìn)行消化，以消除模板質(zhì)粒對于后續(xù)獲取重組質(zhì)粒的干擾?；蛘咴赑CR之前宜先通過雙酶切進(jìn)行線性化處理，以消除模板導(dǎo)致的假陽性克隆。
f. PCR擴(kuò)增獲取線性質(zhì)粒時，宜使用高保真的DNA聚合酶，例如信裕生物的BeyoFusion™ DNA Polymerase (D7220, D7221)，BeyoFusion™ DNA Polymerase (D7222, D7222B)或Pfu DNA Polymerase (D7216, D7217)。
2. 待插入片段的制備
a. 如果待插入片段是非常小的片段，例如20-70bp，可以通過單鏈DNA(常被稱為引物)的合成和退火進(jìn)行制備；如果待插入片段的長度比較長不能直接進(jìn)行合成，可以通過PCR擴(kuò)增的方法進(jìn)行制備。
b. 無論是合成退火還是PCR擴(kuò)增獲得的待插入片段，在其兩側(cè)必須含有15-25bp序列與擬連接的載體或DNA片段完全重疊，后續(xù)重疊區(qū)域會發(fā)生重組，從而獲得預(yù)期的重組質(zhì)粒(參考圖1)。
c. 通過PCR擴(kuò)增獲得待插入片段時，可以在設(shè)計(jì)引物時在兩條引物的5' 端加上與擬連接的載體或DNA片段上完全重疊的15-25nt的序列。引物設(shè)計(jì)的要求和普通的引物設(shè)計(jì)要求相同，需要適當(dāng)避免引物自身的二級結(jié)構(gòu)、形成引物二聚體和GC含量過高等；并且在引物的5' 端加上15-25nt后，仍然要求整條序列適當(dāng)避免自身的二級結(jié)構(gòu)、二聚體和GC含量過高等。
d. 插入單個片段的引物設(shè)計(jì)方法可以參考圖3。圖3A中給出了常規(guī)的無縫克隆的引物設(shè)計(jì)方法實(shí)例的示意圖，獲得的克隆完全是無縫的。圖3B中給出了保留插入位點(diǎn)兩側(cè)酶切位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)方法實(shí)例的示意圖，獲得的重組克隆可以保留兩側(cè)的酶切位點(diǎn)，以便于后續(xù)的酶切鑒定或者亞克隆等。

圖3. 使用本試劑盒把單個片段插入到載體中的引物設(shè)計(jì)實(shí)例示意圖。A. 目的序列插入到pCMV-Blank (D2602)載體中的無縫克隆引物設(shè)計(jì)示意圖。pCMV-Blank用HindIII和XhoI雙酶切線性化。選取圖中所示的包含了重疊序列和基因特異引物序列的引物用于PCR擴(kuò)增待插入片段，PCR產(chǎn)物切膠回收后與線性化的pCMV-Blank使用本試劑盒進(jìn)行重組反應(yīng)。B.目的序列插入到pCMV-Blank載體中并保留酶切位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)示意圖。pCMV-Blank用HindIII和XhoI雙酶切線性化。選取圖中所示的包含了重疊序列、酶切位點(diǎn)和基因特異引物序列的引物用于PCR擴(kuò)增待插入片段，PCR產(chǎn)物切膠回收后與線性化的pCMV-Blank使用本試劑盒進(jìn)行重組反應(yīng)。前者的優(yōu)點(diǎn)在于引物設(shè)計(jì)簡單，可以實(shí)現(xiàn)無縫克隆，后者的優(yōu)點(diǎn)在于多了兩個酶切位點(diǎn)，便于后續(xù)的酶切鑒定或亞克隆。此外，如果計(jì)劃使用本試劑盒把目的片段克隆到信裕生物的pCMV系列質(zhì)粒中，上圖中的重疊序列可以參考使用。

e. 插入多個片段的引物設(shè)計(jì)方法可以參考圖4。通?？梢韵攘谐鏊杩寺∑蔚男蛄校瑯?biāo)注出片段之間的相鄰處，從相鄰處挑選15-20bp作為重疊序列。重疊序列的挑選需要滿足常規(guī)的引物設(shè)計(jì)要求，即需要適當(dāng)避免引物自身的二級結(jié)構(gòu)、形成引物二聚體和GC含量過高等。重疊序列可以僅在一個插入片段中(圖4中紅色DNA序列)，也可以分布在兩個片段中(下圖中藍(lán)色DNA序列)。重疊序列宜盡量設(shè)計(jì)為8個G或C和8個A或T，同時使退火溫度不低于48℃(以AT配對為2℃，GC配對為4℃進(jìn)行粗略計(jì)算)。隨后利用重疊序列和基因特異的序列來設(shè)計(jì)相應(yīng)的PCR引物，每個片段單獨(dú)擴(kuò)增后，所獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和切膠純化即可用于本試劑盒的重組反應(yīng)。

圖4. 使用本試劑盒把3個片段插入到線性化載體中的引物設(shè)計(jì)實(shí)例示意圖。如果需要插入更多的片段，可以參考上述實(shí)例示意圖進(jìn)行。

3. 取出試劑盒的4個組分，Nuclease free water置于室溫，其余置于冰上。參考下表配制如下反應(yīng)體系：

a. 當(dāng)插入1-2個片段時，片段和載體的摩爾比為3:1左右時，重組效率最高。
b. 當(dāng)插入片段小于200bp時，建議插入片段和載體的摩爾比為5:1。
4. 上述反應(yīng)體系置于50℃孵育15 min(插入1-2個片段)、30 min(同時插入3個片段)或60 min(同時插入4-5個片段)。反應(yīng)完成后如不能立即進(jìn)行后續(xù)操作，可將反應(yīng)樣品保存于-20℃。
5. 轉(zhuǎn)化及克隆鑒定。
a. 取5μl上一步驟的反應(yīng)樣品加入到50-100μl DH5α等感受態(tài)細(xì)胞中(注意所加入的DNA樣品體積不要超過感受態(tài)體積的1/10)，輕輕混勻，將該混合物置于冰上30min。
b. 42℃水浴中90秒進(jìn)行熱激，然后迅速放回冰浴中，靜置3~5min。
c. 加入500 μl不含抗生素的SOC或LB培養(yǎng)液，輕輕混勻，37℃震蕩培養(yǎng)1h。
d. 將菌液5000 rpm離心1 min以沉淀菌體。吸去大部分培養(yǎng)液，剩余約50-100μl的培養(yǎng)液，重懸菌體。然后全部均勻涂布到含
適當(dāng)抗生素的LB平板上，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。
e. 第二天挑取平板上的克隆進(jìn)行菌落PCR或者提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，也可以直接選取數(shù)個克隆進(jìn)行測序鑒定。

常見問題：
1. 轉(zhuǎn)化效率低，菌落很少甚至沒有
a. 為確保試劑盒正常工作，請用試劑盒提供的線性化載體和插入片段進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)。
b. 引物序列設(shè)計(jì)不正確。檢查引物序列，確保引物兩端有15-25bp的同源臂以用于與相鄰片段進(jìn)行同源組裝。
c. 感受態(tài)細(xì)胞對重組反應(yīng)體系過敏。使用水對重組后的反應(yīng)液稀釋5-10倍后再進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
d. PCR產(chǎn)物不純或插入片段即線性化載體濃度過低。采用凝膠電泳和膠回收的方法對PCR產(chǎn)物和線性化載體進(jìn)行純化，嚴(yán)格按照說明書推薦的摩爾比和濃度進(jìn)行插入片段和線性化載體的混合。在20μl總反應(yīng)體系中，插入片段和線性化載體混合后體積應(yīng)盡量小于5μl，但如果插入片段和線性化載體用水溶解或洗脫的，體積可以不受此限制。
e. 轉(zhuǎn)化細(xì)菌時重組反應(yīng)樣品加入過多。確保重組反應(yīng)樣品的體積不超過感受態(tài)細(xì)胞體積的10%。
f. 感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率過低。用高效率感受態(tài)重新轉(zhuǎn)化。
g. 選擇了錯誤的抗生素，或在固體LB培養(yǎng)基中加入了過量抗生素。涂板時選擇正確的抗生素和濃度。
2. 陽性率過低
a. 載體線性化不完全。建議延長酶切時間至過夜并凝膠電泳后切膠回收。
b. 模板質(zhì)粒污染。以質(zhì)粒為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過凝膠電泳和切膠純化，這樣可以有效去除模板質(zhì)粒。使用載體為模板通過PCR擴(kuò)增得到線性化載體時，推薦使用DpnI酶消化以消除模板質(zhì)粒的干擾。
c. LB平板過期或用平板配制時使用了錯誤的抗生素，確保使用的LB平板是1個月內(nèi)配制的，并檢查載體的抗性。
3. 陽性克隆含有錯誤的插入片段
PCR產(chǎn)物含有不正確的插入片段。優(yōu)化PCR反應(yīng)引物設(shè)計(jì)以增加PCR產(chǎn)物的特異性，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳和切膠純化。
4. 平板上有很多小菌落
有些外源蛋白的表達(dá)對大腸桿菌是有毒的，此時需要考慮采用低拷貝質(zhì)粒進(jìn)行克隆。