BeyoRT™ III cDNA鏈合成試劑盒

信裕生物生產(chǎn)的BeyoRT™ III cDNA鏈合成試劑盒，即BeyoRT™ III First Strand cDNA Synthesis Kit，是一種采用了經(jīng)過(guò)改造和優(yōu)化的快速高效(短至10min完成反轉(zhuǎn)錄)、熱穩(wěn)定(高達(dá)55℃)、高精確度、產(chǎn)物超長(zhǎng)(長(zhǎng)達(dá)12kb)的BeyoRT™ III M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，可以用于以總RNA、mRNA等為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈的試劑盒。本試劑盒包含了進(jìn)行cDNA鏈合成所需的各種試劑。
使用本試劑盒合成的鏈，可以直接用于后續(xù)的常規(guī)PCR、real-time PCR也稱定量PCR(quantitative PCR, qPCR)、cDNA的第二鏈合成以及cDNA文庫(kù)的構(gòu)建, 尤其是逆轉(zhuǎn)錄所得目的基因的克隆等。
使用本試劑盒可以輕松完成長(zhǎng)度為8 kb以下基因的反轉(zhuǎn)錄(參考圖1)，反轉(zhuǎn)錄的長(zhǎng)度可以達(dá)到12 kb。

圖1. 使用本試劑盒對(duì)總RNA反轉(zhuǎn)錄后，對(duì)于不同長(zhǎng)度的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的電泳效果圖。圖中可見對(duì)于0.2-12kb的cDNA可以非常高效地被反轉(zhuǎn)錄。

本試劑盒中的BeyoRT™ III M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶熱穩(wěn)定性好，反轉(zhuǎn)錄的效率高。本產(chǎn)品最適反應(yīng)溫度為42℃，當(dāng)溫度達(dá)到50℃時(shí)仍具有很高活性，對(duì)于長(zhǎng)度較短的cDNA反轉(zhuǎn)錄，溫度達(dá)到55℃時(shí)也可獲得較高產(chǎn)量的cDNA。高溫反轉(zhuǎn)錄對(duì)于高GC含量RNA的反轉(zhuǎn)錄，能有效減少二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高反轉(zhuǎn)錄效率。反轉(zhuǎn)錄的速度快，反轉(zhuǎn)錄的速度快，6kb以下的cDNA反轉(zhuǎn)錄只需0.5h即可完成，3kb以下的cDNA反轉(zhuǎn)錄10min即可完成(參考圖2)。

圖2. BeyoRT™ III M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶在不同溫度反應(yīng)不同時(shí)間的反轉(zhuǎn)錄效果。從HEK293T細(xì)胞抽提獲得的總RNA 2µg，在20μl反轉(zhuǎn)錄體系中按照?qǐng)D中所示溫度、時(shí)間進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄后取1μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行目的基因(2.6kb的YWHAZ基因和6.0kb的ADAR1基因)的PCR擴(kuò)增和電泳。

本試劑盒提供了RNase Inhibitor，確保在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的RNA不會(huì)被RNA酶所降解并取得良好的反轉(zhuǎn)錄效果。
本試劑盒還提供了Oligo(dT)₁₈和random hexamer這兩種引物，前者適合用于帶有Poly(A)尾的mRNA的反轉(zhuǎn)錄，后者適合用于任何RNA的反轉(zhuǎn)錄。也可以自行采用基因特異性引物進(jìn)行cDNA鏈的合成。
失活或抑制：80℃孵育10min可以導(dǎo)致本產(chǎn)品中的BeyoRT™ Ш M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶失活；EDTA、EGTA等螯合劑、無(wú)機(jī)磷酸鹽或焦磷酸鹽以及聚氨(polyamine)對(duì)BeyoRT™ Ш M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶有抑制作用。
用于體積為20微升的cDNA鏈合成反應(yīng)時(shí)，不同包裝的本試劑盒足夠分別進(jìn)行20個(gè)、100個(gè)和500個(gè)cDNA鏈樣品的合成。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存。
注意事項(xiàng)：
對(duì)于GC含量比較高的RNA的反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)品的使用說(shuō)明中給予了特別說(shuō)明，請(qǐng)予以關(guān)注。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。 
 

使用說(shuō)明：
1. cDNA條鏈的合成(First-stand cDNA Synthesis)：
a. 參考如下表格設(shè)置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RNase Inhibitor (R0102)和dNTP mix (D7373)可從信裕生物訂購(gòu))：

*To 12μl表示加入DEPC-treated Water至最終體積為12μl。
b. 輕輕混勻(用移液器輕輕吹打混勻或用渦旋混合器在最低速度輕輕混勻)，隨后離心沉淀液體。
c. 如果使用Oligo(dT)₁₈或基因特異性引物，42℃孵育10-60 min。如果使用random hexamer(隨機(jī)六聚體)作為引物，先在25℃孵育10 min，隨后在42℃孵育10-60 min。反轉(zhuǎn)錄3kb以下的cDNA，反轉(zhuǎn)錄10min即可，反轉(zhuǎn)錄3-6kb的cDNA，反轉(zhuǎn)錄30min即可，而6kb以上的cDNA推薦反轉(zhuǎn)錄60min。當(dāng)使用random hexamer(隨機(jī)六聚體)作為引物，并且后續(xù)用于qPCR時(shí)，檢測(cè)任何長(zhǎng)度的基因，均反轉(zhuǎn)錄10min就足夠了。注意：對(duì)于GC含量較高或二級(jí)結(jié)構(gòu)比較嚴(yán)重的模板RNA，可以50℃反轉(zhuǎn)錄60min，以充分利用本產(chǎn)品中的反轉(zhuǎn)錄酶在50℃時(shí)仍有良好活性這一特點(diǎn)，在較高溫度進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄可以有效減少二級(jí)結(jié)構(gòu)的干擾。
d. 80℃孵育10 min以失活BeyoRT™ III M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶并終止反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。說(shuō)明：對(duì)于5kb以上的長(zhǎng)片斷cDNA不推薦采用加熱的方法失活反轉(zhuǎn)錄酶，該方法易導(dǎo)致部分長(zhǎng)片斷DNA被剪切，此時(shí)可考慮酚氯仿抽提或柱純化方法。
e. 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以直接用于后續(xù)的PCR反應(yīng)等，也可以-20℃凍存以備以后使用。用于后續(xù)PCR反應(yīng)時(shí)，如果PCR的反應(yīng)體系為20和50微升，則推薦相應(yīng)地使用0.8和2微升反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
2. 引物延伸、探針標(biāo)記等其它用途請(qǐng)自行參考M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶的相關(guān)文獻(xiàn)資料進(jìn)行。

常見問題：
1. 總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物電泳觀察不到。
反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物由于是從模板反轉(zhuǎn)錄而獲得，而模板的量本身比較低，反轉(zhuǎn)錄的量通常還要少于模板量，并且總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大小很不均勻，因此通?？俁NA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物直接電泳觀察是觀察不到的。
2. 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過(guò)PCR擴(kuò)增沒有特異性條帶。
a. PCR擴(kuò)增沒有獲得特異性條帶時(shí)建議先使用actin、GAPDH等作為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，看是否可以成功擴(kuò)增。如果可以成功，則說(shuō)明PCR擴(kuò)增體系沒有問題，此時(shí)通常是目的基因的引物設(shè)計(jì)欠佳，當(dāng)然也有可能是反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物質(zhì)量欠佳。如果內(nèi)參不能被很好地?cái)U(kuò)增，則有可能PCR體系存在問題或反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物質(zhì)量欠佳。
b. 模板RNA發(fā)生了降解。哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織的總RNA瓊脂糖電泳后應(yīng)該可以看到清晰的18S和28S rRNA條帶，并且28S rRNA和18S rRNA的亮度比例應(yīng)該大于等于2.0。如果比例小于2.0，則提示總RNA發(fā)生了顯著的降解，能重新制備總RNA樣品。避免RNA降解的主要方法是，嚴(yán)格進(jìn)行RNA的相關(guān)操作，包括帶潔凈手套、戴一次性口罩、在潔凈環(huán)境中抽提或制備RNA，以盡量避免RNase污染。
c. 模板RNA的純度偏低。在提取純化RNA的過(guò)程中，殘留在溶液中的一些成分如苯酚、SDS、EDTA、胍鹽、磷酸、焦磷酸、多胺、亞精胺等會(huì)抑制反轉(zhuǎn)錄酶活性。對(duì)RNA樣品進(jìn)行柱純化，或者進(jìn)行沉淀、洗滌和再溶解，通?？梢杂行コ龤埩舻奈廴疚?。通常選擇使用信裕生物的BeyoZol或Trizol抽提獲得的總RNA完全可以滿足反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的需要。
d. 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的模板量不足。在抽提獲得總RNA后，在進(jìn)行一些精細(xì)的定量檢測(cè)時(shí)通常會(huì)進(jìn)行DNase I消化，以充分去除可能的殘留的DNA的干擾。DNase I進(jìn)行熱失活時(shí)，需要加入EDTA至終濃度為2.5mM，否則RNA在沒有螯合劑的情況下，在加熱過(guò)程中容易被水解，從而導(dǎo)致模板量不足。此外，擴(kuò)增特定基因時(shí)，需要先查詢?cè)摶虻慕M織分布特點(diǎn)，利用其高表達(dá)的組織進(jìn)行目的基因的反轉(zhuǎn)錄和克隆。用該基因豐度極低的組織或細(xì)胞樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，通常會(huì)由于模板量過(guò)少而PCR擴(kuò)增失敗。
e. 沒有使用適當(dāng)?shù)姆崔D(zhuǎn)錄引物。對(duì)于細(xì)菌RNA和不含poly(A)尾巴的RNA，要用random hexamer引物代替Oligo(dT)₁₈引物。使用基因特異性反轉(zhuǎn)錄引物時(shí)，需要確?；蛱禺愋砸镌O(shè)計(jì)合理正確。
如果RNA模板富含GC或容易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，此時(shí)可以考慮把反轉(zhuǎn)錄溫度提高到45-55℃。