動(dòng)植物膜蛋白微量制備試劑盒

產(chǎn)品及特點(diǎn) 細(xì)胞膜蛋白質(zhì)參與了很多重要的細(xì)胞活動(dòng)，根據(jù)它們與膜結(jié)合的位置一般分為兩種，一種是附著在細(xì)胞膜上，另一類是嵌入到細(xì)胞膜中間。附著型膜蛋白疏水性較弱，比較容易提取和純化；而嵌入型膜蛋白疏水型很強(qiáng)，所以在水溶液里面很難溶解，非常難以提取和純化。天恩澤基因根據(jù)上述特點(diǎn)，經(jīng)過精心優(yōu)化的、開發(fā)出本產(chǎn)品，專門用于分離純化這兩種膜蛋白。它具有下列特點(diǎn)：

1. 兩步法提取，先純化含膜組分，再分離附著型膜蛋白和嵌合型膜蛋白。

2. 膜蛋白（附著型+嵌入型）產(chǎn)量高，對(duì)肝臟組織而言，其線粒體膜蛋白產(chǎn)率為 10 ug/mg 左右，過氧化物酶體為 1 ug/mg 左右，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為 25-30ug/mg。

3. 所得的膜蛋白大部分具有生物活性，可用于活性研究。

4. 可用動(dòng)物、植物培養(yǎng)細(xì)胞和實(shí)體細(xì)胞為材料，也可用預(yù)先純化的含膜組分或細(xì)胞器（如線粒體、葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物酶體）為材料（本試劑盒不含純化細(xì)胞器的試劑）。

5. 本方法重復(fù)性好。

6. 本試劑盒足夠 50 次微量提取，分 A 型和 B 型兩種。A 型用于附著型膜蛋白，B 型用于嵌合型膜蛋白和附著型膜蛋白。

運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸及保存，有效期一年。

自備試劑 PBS，電泳上樣液。

使用方法 1、 對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞：收集 1×107 個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞（動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞），用 20 mL自備的冰浴的 PBS 洗滌三次，每次洗滌后需要 4℃下 1000 g 離心 2 分鐘，然后小心棄上清。對(duì)實(shí)體組織：由于各種動(dòng)植物的各種實(shí)體組織的屬性差別太大，故本手冊(cè)的純化膜組分的操作步驟（第 1-7 步）不一定完全適合，用戶需要自行優(yōu)化以純化含膜組分或含膜的細(xì)胞器（如細(xì)胞質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、葉綠體等），再將含膜組分或細(xì)胞器沉淀直接用于第 8 步的膜蛋白提取。

2、 將洗滌后的細(xì)胞沉淀重懸在 2 mL 溶液 A 中，冰上靜置 10 分鐘。注意：膜蛋白有膜的保護(hù)，在純化過程中對(duì)蛋白酶的降解沒有胞漿蛋白敏感，一般可以不加蛋白酶抑制劑。但如果純化的膜蛋白的確有降解的話，可以在溶液 A 中加入自備的蛋白酶抑制劑混合物。

3、 轉(zhuǎn)移到容積為 2 mL 的 Dounce 玻璃勻漿器上下勻漿 20-50 次（具體次數(shù)取決于細(xì)胞種類，293T 細(xì)胞一般需要 20 次左右，而 MEF 細(xì)胞一般需要50 次左右。用樣品先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以摸索佳勻漿次數(shù)，佳勻漿次數(shù)時(shí)在顯微鏡下能看見細(xì)胞破裂但細(xì)胞核完整）。

4、 將勻漿液轉(zhuǎn)移到 15 或 50 mL 塑料管中，加入相當(dāng)于勻漿液體積 1/10 的溶液 B，其間可以輕柔顛倒混勻 3-5 次，留少量樣品作為對(duì)照 1（勻漿液）。

5、 4℃ 2500 rpm 離心 20 分鐘，沉淀為細(xì)胞核，上清為胞漿和膜成分，留少量樣品作為對(duì)照 2（胞漿和膜成分）。

6、 將上清液用 Beckman Optima 臺(tái)式超速離心機(jī) 100,000 g 4℃離心 60分鐘。也可以使用其他冷凍超速離心機(jī)，但離心力應(yīng)該為 100,000g，否則有可能得不到膜成分沉淀。

7、 小心轉(zhuǎn)移上清（胞漿部分）并留少量樣品作為對(duì)照 3（胞漿）。

8、 將沉淀（含膜組分）重懸于 1 mL 冰浴的溶液 C 中后，冰上靜置 30 分鐘，留少量樣品作為對(duì)照 4（膜成分）。本成分電泳前，需要先用自備的 TCA沉淀（TCA 終濃度為 10%），再用冰冷的丙酮洗滌兩次后再溶解在 1×上樣液中待用。對(duì)照 1-3 號(hào)不需要這樣的預(yù)處理。

9、 用 Beckman Optima 臺(tái)式超速離心機(jī) 100,000g 4℃離心 60 分鐘。也可以使用其他冷凍超速離心機(jī)，但離心力應(yīng)該一致，否則有可能得不到沉淀。

10、如果需要附著型膜蛋白，則取上清（含附著型膜蛋白）棄沉淀（含膜和其中的嵌合型膜蛋白）。上清可以放-20℃長期保存，如果需要電泳，需要先用自備的 TCA 沉淀（TCA 終濃度為 10%），再用冰冷的丙酮洗滌兩次后再溶解在 1×上樣液中與對(duì)照 1-4 號(hào)一起上樣電泳。

11、如果需要嵌合型膜蛋白，則取出上清（含附著型膜蛋白）并留少量樣品作為附著型膜蛋白樣品，然后再用 1 mL 冰浴的溶液 C 重懸沉淀，然后100,000g 4℃離心 60 分鐘，去掉上清（上清含殘留的附著型膜蛋白，可 以留樣作為洗滌后的附著型膜蛋白樣品）。沉淀含膜和其中的嵌合型膜蛋 白。如果需要測定膜蛋白的濃度，則將其溶解在自備的 0.5 M NaOH 溶液