免RNA提取RT-PCR試劑盒

產(chǎn)品及特點(diǎn)本產(chǎn)品是一種免 RNA 提取的 RT-PCR 試劑盒，它使用精心優(yōu)化的細(xì)胞裂解液直接裂解培養(yǎng)細(xì)胞，然后直接在細(xì)胞裂解液中進(jìn)行 RT，再用 cDNA 進(jìn)行 PCR或熒光定量 PCR。本產(chǎn)品特點(diǎn)如下：

1. 免 RNA 提取，從細(xì)胞裂解到 RT-PCR 或?qū)崟r(shí)定量 RT-PCR 結(jié)果只需三個(gè)步驟，省略了整個(gè) RNA 提取過程。

2. 靈敏度不低于常規(guī)方法（先提總 RNA 再進(jìn)行 RT-PCR），不但可以檢測(cè)到低拷貝的 RNA，還可用于檢測(cè) miRNA。

3. 整合了去除基因組 DNA 的步驟，只檢測(cè) RNA，無需擔(dān)心基因組 DNA 的污染。

4. 每次只需要 10-100000 個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞或含相應(yīng)細(xì)胞數(shù)的痕量組織（如 LCM樣品），驗(yàn)證過的細(xì)胞包括 Hela、CHO、293、COS-7 等，但不能用于U937 細(xì)胞系。

5. 兩步法 RT-PCR，后續(xù)使用靈活。得到的 cDNA 既可用于普通 PCR，也可用于基于 SYBR 的熒光定量 PCR，也可用于其他定量 PCR（如 TaqMan），非常靈活。

6. 即適用于少量樣品，也適用于平行處理大量樣品及高通量篩查。

7. 本產(chǎn)品足夠用于 50 次 20μL 體系的 RT 和 600 次 30μL 體系（或約 200 次100μL 體系）的 PCR。
規(guī)格及成分 成 分 編 號(hào) 十孔盒包裝
溶液 A 130957a 25 mL
溶液 B 130957b 0.5 mL
MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 (含 RI) 60906a 100 μL
RT Buffer（含 dNTP） 60906b 300 μL
PCR MagicMix 3.0(含染料) 90805 9 mL
RNase-free 水 80403 10 mL
使用手冊(cè) 130957sc 1 份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期兩年。

自備試劑 RT 引物、PCR 引物對(duì)

使用方法注意：無 RNase 的環(huán)境和使用無 RNase 污染的試劑是本實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。 強(qiáng)烈建議使用的固相 RNase 清除劑去除工作臺(tái)面的 RNase，用氣相 RNase 去除空氣中的 RNase。實(shí)驗(yàn)前需要將 95%乙醇放-70℃預(yù)冷，用空 槍頭盒盛乙醇。

一、細(xì)胞培養(yǎng)、裂解

1. 按常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞、胰酶消化并計(jì)數(shù)。

2. 轉(zhuǎn)移 1×10E5 個(gè)細(xì)胞到離心管中，400×g 離心 4 分鐘。

3. 吸棄上清（即培養(yǎng)基），保留細(xì)胞沉淀。

4. 用 0.5 mL 溶液 A 重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞濃度調(diào)整到 2×10E5 細(xì)胞/mL。

5. 轉(zhuǎn)移 10 μL 的懸浮細(xì)胞到 0.2 mL PCR 管中，并加入 10 μL 的溶液 B，此 時(shí)細(xì)胞終濃度為 10E5 細(xì)胞/mL。

6. 迅速將離心管插入浮子中，放入-70℃預(yù)冷的、95%乙醇中 1-3 分鐘。10 μL 槍頭盒一般能讓 0.2 mL 的 PCR 管一半沒入到乙醇中。

7. 在室溫的水浴鍋中快速解凍細(xì)胞，渦旋 10 秒后短暫離心數(shù)秒，將管中液體 （細(xì)胞裂解液）轉(zhuǎn)移到新的離心管中，放冰上待用。

二、RT（逆轉(zhuǎn)錄）反應(yīng)合成 cDNA

8. 按下表設(shè)置 RT 反應(yīng)體系（以 20 μL 體系為例）:

成分 樣品管 陰性對(duì)照管 細(xì)胞裂解液（含 RNA） 2.5 μL 2.5 μL RT Buffer（含 dNTP） 6 μL 6 μL MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（含 RI） 2 μL 無 RT 引物(100ng/μL) 1 μL 1 μL RNase-free 水 補(bǔ)水到 20 μL 補(bǔ)水到 20 μL

9. 42℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應(yīng)。

10. 70℃保溫 10 分鐘以終止反應(yīng)，然后放冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作 為 PCR 模板使用，不需要純化。也可以放置在-20℃長期保存。 三、PCR 方案一（RT 產(chǎn)物全部用于 PCR）

11.在上步的 RT 反應(yīng)管中直接按下表加入各成分（以 100 μL 體系為例）： 成分 每管加入量 PCR MagicMix 3.0（已加染料） 50 μL 自備正向 PCR 引物 (100 ng/μL) 2 μL RNase-free 水 補(bǔ)水到 100 μL

12.直接進(jìn)入第 14 步。

四、PCR 方案二（部分 RT 產(chǎn)物用于 PCR）

13.按下表設(shè)置 PCR 反應(yīng)體系（以 30 μL 體系為例）：

成分 每管加入量

PCR MagicMix 3.0（已加染料） 15 μL

cDNA 樣品（RT 反應(yīng)產(chǎn)物） 1-5 μL

自備正向 PCR 引物 (100 ng/μL) 1 μL

自備反向 PCR 引物 (100 ng/μL) 1 μL

RNase-free 水 補(bǔ)水到 30 μL

注意：RT 引物可以用做反向 PCR 引物。

14. PCR 反應(yīng)參數(shù)(需要根據(jù)模板和引物 Tm 值決定，下面的參數(shù)只做參考)：

過程 溫度 時(shí)間

預(yù)變性 94℃ 5 min

PCR 反應(yīng)

（35 個(gè)循環(huán)）

94℃ 1 min

55℃ 1 min

72℃ 2 min

后延伸 72℃ 10 min

四、電泳檢測(cè)

15.取 5-10 μL PCR 產(chǎn)物直接在瓊脂糖凝膠上電泳，跟分子量標(biāo)準(zhǔn)比較估計(jì)出擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。注：本試劑盒中的 PCR mix 含有甘油和染料，可以直接上樣，不需要額外再加電泳上樣液。