一步式RT-PCR Mix

產(chǎn)品及特點(diǎn)本產(chǎn)品是高效 cDNA 合成和 PCR 擴(kuò)增的一步法 RT-PCR 試劑盒，于以RNA 為模板，通過特異引物合成 cDNA 之后，在 DNA 聚合酶的作用下通過 PCR技術(shù)檢測目標(biāo)基因的含量。本產(chǎn)品特點(diǎn)如下：

1. 實(shí)現(xiàn)一管式完成 RT-PCR 反應(yīng)，避免樣品交叉污染。

2. 反應(yīng)產(chǎn)物加入 Loading Buffer 后可以直接電泳檢測。

3. 本產(chǎn)品包含了 cDNA 合成以及 PCR 反應(yīng)所必須的酶和反應(yīng)體系，優(yōu)化的Buffer 體系程度的減少了反轉(zhuǎn)錄酶對擴(kuò)增反應(yīng)的抑制，提高了反應(yīng)整體的敏感性。

4. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的 RT-PCR，只能用于科研目的。
規(guī)格及成分 成 份 編 號 十孔盒包裝
一步式 RT-PCR Mix，5× 130609a 75 μL
RT Buffer，5 × 130609b 200 μL
DEPC-ddH2O 80403-1 1 mL
使用手冊 130609sc 1 份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。 

自備試劑 1. RNA 模板

2. 自備引物。

使用方法 一、樣品 RNA 的制備

1. 用自選方法純化樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) RNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的 RNAout 系列產(chǎn)品。

二、設(shè)置一管式 RT-PCR 反應(yīng)（20 μL 體系）

2. 在 N+1 個(gè)干凈的無 RNase 的 PCR 管中（N=樣品數(shù)，另外一個(gè)是陰性對照。用戶可以設(shè)置其他對照，樣品數(shù)需相應(yīng)增加），按下表加入各成分：成分 陰性對照管 樣品管

RNA 模板（自備） 無 1-2 μg

上游引物（10 μM） 0.5 μL 0.5 μL

下游引物（10 μM） 0.5 μL 0.5 μL

RT Buffer，5 × 4 μL 4 μL 一步式 RT-PCR Mix，5× 1.5 μL 1.5 μL

DEPC-ddH2O 補(bǔ)到 20 μL 補(bǔ)到 20 μL

3. 輕柔混合均勻后放入 PCR 儀中進(jìn)行 RT-PCR。

4. 設(shè)定 RT-PCR 反應(yīng)條件時(shí)，一般將 RT 的條件設(shè)定成 50℃ 30 min，后接 94℃預(yù)變性 2 min，94℃變性 30 sec，退火 50-60℃ 30 sec，延伸 72℃ 1 kb/min，最后 3 步重復(fù) 30-40 個(gè)循環(huán)。終延伸 72℃ 5-10 min。 注意事項(xiàng) 1. 實(shí)驗(yàn)過程中請注意避免 RNase 污染。

2. 除酶以外的各種試劑，使用之前請完全溶解并充分混勻，以防因鹽離子濃度不均影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3. RNA 模板的完整性對 cDNA 合成效率起著決定性作用，因此請選擇可靠的 RNA提取/純化方法。

4. 如果擴(kuò)增片段較長或者 RNA 結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可以將 RNA 單獨(dú)置于 65-70℃加熱5-10 min 后再加入體系