PCR法DNA探針生物素標記試劑盒

產品及特點PCR 標記的原理是用帶標記的 dNTP 進行 PCR，最后得到的 PCR 產物 將帶有標記，可以直接用于雜交試驗。本產品就是基于上述原理的基礎上開 發(fā)，它具有下列特點：

1. 一站式，本試劑盒提供經過優(yōu)化的試劑，不需要用戶自己摸索。

2. 足夠 10 次 50 uL 體系的常規(guī) PCR（用于制備標記反應的模板和設置對 照反應）和 5 次 50 uL 體系的標記反應。

3. 一次標記可以得到ug級的雙鏈DNA探針或約700ng 的單鏈DNA探針， 足夠多次雜交實驗用。

4. 既可用于制備雙鏈探針，也可以用于單鏈探針。

5. A 型需自備含標記核苷酸的 dNTP， B 和 C 型分別含生物素和地高辛標 記的底物?？捎玫淖詡錁擞浀孜锇?fluorescein-dUTP、 hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP 和 aminoallyl-dUTP 等。

6. 摻入率一般為 4-5%，有效降低了空間阻礙，檢測效果。

7. 標記探針可以用于 Southern 和 Northern Blot、原位雜交、菌落和斑 點印跡雜交等分析。

8. 本產品足夠 5 次非標記 PCR 和 5 次標記 PCR（均指 50uL 體系）。
規(guī)格及成分 A 型成 份 編 號 十孔盒包裝
2×標記專用 PCR Mix LM90604a 500uL(黃蓋)
dATP，10 mM each LM130912 50uL(白蓋)
dTTP，10 mM each LM130913 50uL(綠蓋)
dGTP，10 mM each LM130914 50uL(紅蓋)
dCTP，10 mM each LM130915 50uL(本色蓋)
超純水 LM100935 1 mL(藍蓋)
使用手冊 LM90604sc 1 份
B 型（生物素）
成 份 編 號 十孔盒包裝
2×標記專用 PCR Mix LM90604a 500 uL(黃蓋)
含 Biotin-11-dUTP 的 dNTP，2mM 90604b 25 uL(綠色)
dNTP Mix，2 mM each 51208 50 uL(白蓋)
超純水 100935 1 mL(藍蓋)
使用手冊 90604sc 1 份
C 型（DIG）
成 份 編 號 十孔盒包裝
2×標記專用 PCR Mix 90604a 500 uL(黃蓋)
含DIG-11-dUTP的dNTP，2mM 90604c 25 uL(綠色)
dNTP Mix，2 mM each 51208 50 uL(白蓋)
超純水 100935 1 mL(藍蓋)
使用手冊 90604sc 1 份

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑 DNA 模板和模板專一性引物。

使用方法一：準備工作

1. 按常規(guī)的方法設計 PCR 引物，使探針長度在 400-800bp 之間。過短則 標記參入少，探針雜交信號強度減弱；過長則非特異雜交增加，背景變強。

2. 由于標記的 dNTP 比較珍貴，所以不推薦以基因組 DNA 或其他復雜 DNA 為模板直接進行 PCR 標記，而是建議采取下述的兩步法標記來提高成功 率，即先制備非標記 PCR 產物，再以之為模板制備標記的 PCR 產物。 

3. 對 A 型標記試劑盒，四種 10mM 的 dNTP 是分開提供，用于制備 50uL 非標記 dNTP（2mM each，用于非標記 PCR，用于制備標記 PCR 的模 板。配制方法是四種 10mM 的 dNTP 各加 10uL，再加水 10uL 即可） 和 25uL 標記 dNTP（2mM each，其中標記核苷酸和對應的非標記核苷 酸的比例需要自行優(yōu)化，假如是 biotin 或 DIG 標記的是 dUTP，則其對 應的非標記核苷酸是 dTTP，兩者的比例一般為 1：3；如果是 BrdUTP，則兩者的比例為 1：1。配制方法是三種 10mM 的 dNTP 各加 5uL，再加標記核苷酸和其對應的標記核苷酸使其總的終濃度為 2mM，再補水到 25uL）。 

二：非標記 PCR 產物的制備

4. 設置50uL非標記PCR：2×標記專用PCR Mix 25 uL，dNTP Mix（2mM each）5uL，自備的探針引物（10pmol/uL）各 1uL，1 ug 基因組 DNA 或 1ng 質粒 DNA，補超純水到 50 uL。

5. 按已經優(yōu)化的 PCR 參數(shù)進行常規(guī) PCR。

6. 膠回 PCR 產物并定量，膠回收可以避免殘留引物干擾后續(xù)的標記 PCR。

三：標記 PCR 反應（做一個不加標記的對照用于定量）

注意：由于雙鏈 PCR 探針在雜交時變性的雙鏈彼此還會復性，降低雜交 效率，因此強烈推薦使用單鏈標記 PCR。

效率，因此強烈推薦使用單鏈標記 PCR。 成份 樣品 非標記對照 2×標記專用 PCR Mix 25 uL 25 uL A 型：含標記核苷酸的 dNTP Mix B 型：含 Biotin-11-dUTP 的 dNTP C 型：含 DIG-11-dUTP 的 dNTP 5 uL 不加 dNTP Mix，2mM 不加 5 uL 若單鏈標記：加探針引物其一 50 pmol 50 pmol 若雙鏈標記：加探針引物一和引物二 各 50 pmol 各 50 pmol 膠純化所得 PCR 產物（單鏈標記可 用 100ng 模板） 10 ng 10 ng 超純水 補到 50 uL 補到 50 uL

注意：本試劑盒提供的 dNTP 混合物總濃度為 2mM，所含標記 dUTP 與 非標記 dTTP 的比例已經進過優(yōu)化。

7. 按第 5 步的 PCR 參數(shù)進行標記 PCR，但需要進行下列修改：一是循環(huán)數(shù) 增加到 35-55 個循環(huán)。由于模板為純化后的 PCR 產物，探針對擴增長度 完整性要求不高（長度不均的探針由于能形成網(wǎng)絡結構，效果反而更好）， 所以可以增加循環(huán)數(shù)；二是延伸時間增加 15 秒，因為標記 dUTP 參入到 DNA 的速度比常規(guī)的 dTTP 慢；三是降低復性溫度 5-7℃，因為標記核 苷酸參入到 DNA 后，新模板的 Tm 值將降低。

8. 標記探針的定量：取標記反應液和對照反應液 1-5 uL，在瓊脂糖凝膠上 跟濃度已知的 DNA marker 一起電泳，并判斷探針的濃度。由于標記產 物中額外帶有生物素，地高辛等、其泳動速度將慢于非標記 PCR 產物（但 同位素標記不能用此法）。下圖是一個典型的雙鏈 PCR 產物電泳結果圖： 標記的 DNA（右）與未標記的 DNA（左）電泳比較

注意：如果擴增的是單鏈 DNA 探針，其結合 EB 的能力遠低于雙鏈 DNA， 因此 EB 染色的強弱不能準確反應 DNA 的真實濃度，可以采用銀染定量（跟 marker 比較）。一般 100ng 模板經單鏈 PCR 擴增可得到 700ng 左右探針。

9. 剩余的 PCR 標記產物可以不經過純化，直接加入（對單鏈 PCR 探針） 雜或加熱變性并急冷后加入（對雙鏈 PCR 探針）到雜交液中使用。也可 放-20℃長期保存。如果需要純化，請使用乙酸銨/乙醇沉淀法純化。