隨機(jī)引物法DNA探針生物素標(biāo)記試劑盒

產(chǎn)品及特點(diǎn)本產(chǎn)品是基于 Feinberg 和 Vogelstein 發(fā)明的隨機(jī)引物標(biāo)記法而開發(fā)出來的即用型 DNA 探針標(biāo)記試劑盒，標(biāo)記過程由雙鏈 DNA 熱變性、隨機(jī)引物與單鏈 DNA 結(jié)合、在 Klenow DNA 聚合酶催化下，引物的延伸合成 DNA 探針并摻入標(biāo)記的核苷酸三步組成， 可用下面的示意圖表示：

本產(chǎn)品對 Feinberg 和 Vogelstein 經(jīng)典方法進(jìn)行了改良，具有下列特點(diǎn)：

1. 提供的標(biāo)記反應(yīng)液整合了除酶和模板外的所有成分，簡化了反應(yīng)加樣步驟，提高了 標(biāo)記反應(yīng)的可重復(fù)性。

2. 使用無外切活性的 Klenow exo- DNA 聚合酶，已標(biāo)記 DNA 探針不會被酶降解。

3. 快速，最快 1 小時即可完成標(biāo)記反應(yīng)。

4. 得到的 DNA 探針比活性高（如果是同位素，可以達(dá)到 109cpm/ug DNA）。

5. 所需模版 DNA 量少，可以是各種形狀（線狀和環(huán)狀）的、也可以是單鏈或雙鏈的， 但長度必須在 100 bp 以上。

6. 得到的探針長度在 200-400 nt 之間，可以用于 Southern 雜交、Northern 雜交、 原位雜交、菌落和斑點(diǎn)印跡雜交等。

7. 提供三種標(biāo)記選擇，其中 90603A 可用于各種同位素和非同位素標(biāo)記，但需自備標(biāo) 記底物；90603B 和 90603C 可分別用于生物素和地高辛標(biāo)記，不需自備標(biāo)記底物。
規(guī)格及成分 A 型成 份 編 號 十孔盒包裝
2×隨機(jī)引物標(biāo)記反應(yīng)液(A 型) 90603a 50 uL
dATP，2 mM 90603d1 10 uL
dTTP，2 mM 90603d2 10 uL
dGTP，2 mM 90603d3 10 uL
dCTP，2 mM 90603d4 10 uL
Klenow exo-聚合酶，2U/uL 90603e 5 uL
超純水 100935 1 mL
使用手冊 90603sc 1 份
B 型（生物素標(biāo)記）
成 份 編 號 十孔盒包裝包裝
2×隨機(jī)引物標(biāo)記反應(yīng)液(B 型) 90603b 50 uL
Klenow exo-聚合酶，2U/uL 90603e 5 uL
超純水 100935 1 mL
使用手冊 90603sc 1 份
C 型（DIG 標(biāo)記）
成 份 編 號 十孔盒包裝包裝
2×隨機(jī)引物標(biāo)記反應(yīng)液(C 型) 90603c 50 uL
Klenow exo-聚合酶，2U/uL 90603e 5 uL
超純水 100935 1 mL
使用手冊 90603sc 1 份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑 0.5M EDTA（pH8.0）。如果是 A 型，則需要自備標(biāo)記的核苷酸。 

使用方法 1. 在一干凈的硅化的塑料離心管中加入下列成分：
成分 用量 模板 DNA 50-150 ng 2×隨機(jī)引物標(biāo)記反應(yīng)液(ABC 三種之一) 10 uL 超純水 補(bǔ)水到 15 uL
注意：非同位素標(biāo)記基團(tuán)疏水性強(qiáng)，易與塑料離心管表面非特異性結(jié)合，所以要硅化 塑料離心管。模板 DNA 并非越多越好，否則會競爭性地抑制探針跟靶分子的雜交。
2. 沸水浴 5-10 分鐘，或在 PCR 儀上 100℃加熱 5-10 分鐘后立即放冰上待用。
3. 高速離心數(shù)秒使所有液體集中在管底，根據(jù)試劑盒類型加入下列成份：
試劑盒類型 成分及用量
A 型 dATP、dGTP、dCTP 各 1 uL（共 3uL，濃度均為 2mM） 自備的 2mM dTTP/標(biāo)記 dUTP 混合物（見注）1uL 1 uL Klenow exo 聚合酶
B 型 1 uL Klenow exo 聚合酶 4 uL 超純水 不需加 dNTP，已經(jīng)包括在 2×隨機(jī)引物標(biāo)記反應(yīng)液（B 型）中
C 型 1 uL Klenow exo 聚合酶 4 uL 超純水 不需加 dNTP，已經(jīng)包括在 2×隨機(jī)引物標(biāo)記反應(yīng)液（C 型）中
注：上表中的 dTTP/標(biāo)記 dUTP 混合物中 dTTP 和標(biāo)記的 dUTP 的總濃度為 2mM， dTTP 與標(biāo)記 dUTP 的比例在 65：35 為佳。但如果使用自備的其他標(biāo)記核苷酸， 如 fluorescein、hydroxycoumarin、resorufin 和 aminoallyl 標(biāo)記的 dUTP，則 用戶需要自己摸索其與 dTTP 之間的佳比例，如果使用 32P 標(biāo)記的 dUTP，則比 活好為 3000Ci/mmol，濃度為好為 10uCi/uL，并且不需要加入 dTTP。
4. 輕柔吹打混勻。如有液滴沾在管壁上，高速離心數(shù)秒使所有液體集中在管底。
5. 37℃保溫 1-20 小時。標(biāo)記效率跟模板量和保溫時間相關(guān)，具體見下表： 模版 DNA 用量 （ng） 1 小時后探針合成量 （ng） 20 小時后探針合成量 （ng） 10 80 900 30 150 1350 100 350 1650 300 750 2200 1000 1300 2600 3000 1600 2600
6. 加 1 uL 自備的 0.5M EDTA（pH 8.0）終止反應(yīng)，加熱 100℃ 5 分鐘使 DNA 探 針變性成單鏈，然后直接加入到雜交反應(yīng)液中即可。如果電泳檢測，標(biāo)記產(chǎn)物將是 彌散狀態(tài)。立即放冰上待用或放-20℃保存一年。用前需要 注意：本方法標(biāo)記核苷酸摻入率極高，因此可以不經(jīng)純化直接使用。如果需要純化， 注意不要用酚抽提法純化非同位素標(biāo)記的 DNA 探針，因為這些標(biāo)記分子疏水性強(qiáng)， 能使標(biāo)記的 DNA 進(jìn)入疏水的有機(jī)相而丟失，但可以用乙醇沉淀和 Sephadex G50 回收（可另購柱式探針純化試劑盒，產(chǎn)品編號 121122）。對比活高的同位素標(biāo)記探 針，由于同位素其極其不穩(wěn)定，因此應(yīng)該立即使用，不要長久放置。