一站式miRNA尿素-PAGE電泳套裝

產品及特點尿素-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Urea PAGE)是目前分離 200 nt 以下的小片段 RNA，尤其是 20 nt 左右的 microRNA(miRNA)分子的主要方法，但是單獨配 制各種溶液十分繁瑣，為此天澤基因開發(fā)了本產品。它具有下列特點:

1. 一站式，含有電泳所需要的所有試劑，即開即用，十分方便，免去了實 驗人員稱取有毒物品。

2. 靈活，可以根據需要配制各種濃度的 Urea-PAGE，以便對長度各異的 RNA 進行電泳。

3. 電泳后可直接用于 UV 觀察、銀染、膠回收、Northern 雜交等實驗。

4. 使用新型緩沖液，可以防止甘油的干擾。 
規(guī)格及成分 成份 編號 大紙盒包裝
運輸及保存 尿素 100873 210 g RT 丙烯酰胺 100864 60g，用 250mL 瓶 RT 甲叉雙丙烯酰胺 100877 3g RT TBE 電泳液, 10× 90313 250 mL RT TEMED 110-18-9 1.5 mL RT 過硫酸銨 100879 1 g RT miRNAON 70608 1.5 mL 低溫/-20℃ miRNA Marker 70605 150 uL 低溫/-20℃ 固相 RNase 清除劑 3090 250 mL RT 使用手冊 70606sc 1 份 RT

運輸及保存 常溫運輸和保存，miRNAon、miRNA Marker 需要低溫運輸，-20℃保存， 保存期一年。

自備試劑 miRNA 樣品、RNase-free 水。

使用方法

1. 準備工作：用固相 RNase 清除劑清潔工作平臺 直接將固相 RNase 清除劑原液或 10 倍的新鮮稀釋液噴于臺面，5 分鐘后 用普通吸水紙擦凈，后用沾有固相 RNase 清除劑 1000 倍新鮮稀釋液的 吸水紙擦凈，晾干。

2. 準備工作：用固相 RNase 清除劑清潔玻璃和塑料器皿 將器皿浸泡在固相 RNase 清除劑的 10 或 100 倍的新鮮稀釋液中，靜置 處理 5 分鐘后取出，再用固相 RNase 清除劑 1000 倍或 10000 倍新鮮稀 釋液浸泡二次以上，倒立晾干后備用。 

3. 配制 1×TBE 電泳液: 將適量的 10×TEB 電泳液用 RNase-free 水稀釋 10 倍，得到 1×TBE 電泳液待用。此溶液需要現(xiàn)用現(xiàn)配，否則易長菌。

4. 配制 10%過硫酸銨溶液: 精確稱取100 mg 過硫酸銨到一干凈的 1.5 mL 離心管中，按每 1 mg 過硫酸銨加 10 μL RNase-free水的比例加入 RNase-free 水，搖晃溶解待用。10%過硫酸銨溶液有效期不超過一周。

5. 估計所需要的凝膠溶液的體積，一般配制一塊 13 cm×15 cm× 0.8 mm 的膠需要 15 mL 凝膠溶液，配制一塊 36 cm×45 cm×0.8 mm 的膠需 要 120 mL 凝膠溶液。

6. 配制 40%的丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺溶液：將 3g 甲叉雙丙烯酰胺加入到 裝有 60g 丙烯酰胺干粉的瓶中，再加入 130 mL RNase-free 水，充分搖 晃混勻即得 40%的 Acrylamide/Bis 溶液。

7. 根據所需要的凝膠溶液的體積，在一的干凈的三角瓶中按下表加入各成分

8. 攪拌并加熱到 40-50℃左右，直到尿素完全溶解。

9. 冷卻到室溫后，將三角瓶接上真空系統(tǒng)抽真空處理 10-15 分鐘以充分去除 溶液中的氧氣（氧氣會降低聚合反應效率）。若條件有限，此步可省略。

10. 邊搖晃溶液變加入 50 μL TEMED 和 500 μL 10%過硫酸銨。注意：如果 選擇其他工作濃度的 Acrylamide/Bis，此二成分的用量不需要隨之改 變。但如果配置的凝膠溶液的體積變化，此二成分的用量要按比例改變。

11. 再充分搖晃約 30 秒后迅速灌膠，然后插入樣品梳，室溫放置 30-60 分鐘
等待膠凝固。

12. 將凝膠板放置在電泳裝置上后，在上下層分別加入適當量的 1×電泳緩沖 液。如果不馬上使用，需要有濕紙將上樣孔端蓋住以防凝膠過度干燥。

13. 拔出梳子后用加樣槍吸取電泳緩沖液，充分將每個加樣空中未聚合的 Acrylamide/Bis、尿素和氣泡吹打出來。

14. 在上樣前，預電泳 20-30 分鐘以使多余的過硫酸銨跑出加樣空，同時還可 以使凝膠的溫度升高（到 50℃左右），有利于 RNA 變性狀態(tài)。

15. 將 miRNA 樣品與等體積的 miRNAon 混合，70℃保溫 2-3 分鐘后迅速放 置在冰上冷卻，快速離心半分鐘，放冰上待用。miRNA Marker 需要每個 上樣孔用 5μL，一塊膠好在兩側各用一個孔上樣 miRNA Marker。

16. 關電泳儀后開始上樣。

17. 重開電泳儀，對 13 cm×15 cm 的膠，以 20-30mA 的電流電泳，直到紅 色染料移動到凝膠邊緣為止；對36 cm×45 cm 的膠，則以 50-60mA 的 電流電泳，直到紅色染料移動到凝膠邊緣為止。

18. 染色觀察：將凝膠一面的玻璃板揭開，直接用仍然附著在另一玻璃板上的 凝膠進行各種染色，包括銀染（固定、漂洗、顯影和定影等步驟）、EB（每 100 mL 1×TBE 中加 20 μL 10mg/mL 的 EB 溶液）、天澤基因低毒核 酸染料 DNAgreen（每 100 mL 1×TBE 中加 10 μL DNAgreen 原 液）。 UV 下觀察并拍照。

19. miRNA 回收：按上法用 EB 等染料染色后，UV 下確定所需要的 miRNA 條帶的位置，切膠后進行膠回收處理。

20. Northern 雜交：按上法用 EB 等染料染色后，UV 下確定所需要的 miRNA 條帶的位置，切膠后電轉移到帶正電的尼龍膜上，然后進行雜交處理。

21. 放射自顯影：如果 miRNA 樣品電泳前經過同位素標記，則將凝膠一面的 玻璃板揭開，用濾紙將附著在另一玻璃板上的凝膠吸附過來，然后包上保 鮮膜，真空抽干，然后使膠跟 X 光片向對置進行放射自顯影。