線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1 ）是一種以 JC-1 為熒光探針，快速靈敏地檢測細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒，可以用于早期的細(xì)胞凋亡檢測。

JC-1 是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位△Ψm 的理想熒光探針?？梢詸z測細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時，JC-1 聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1 不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時 JC-1 為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光。這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。

線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個標(biāo)志性事件。通過 JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測到細(xì)胞膜電位的下降，同時也可以用 JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個檢測指標(biāo)。

JC-1 單體的激發(fā)波長為 515nm ，發(fā)射波長為 529nm ；JC-1 聚合物的激發(fā)波長為 585nm ，發(fā)射波長為 590nm 。實(shí)際觀察時，使用常規(guī)的觀察紅色熒光和綠色熒光的設(shè)置即可。

本試劑盒提供了 CCCP 作為誘導(dǎo)線粒體膜電位下降的陽性對照。以 100T 為例，對于六孔板中的樣品，本試劑盒共可以檢測 100 個樣品；

對于 12 孔中的樣品，本試劑盒共可以檢測 200 個樣品。

注意事項(xiàng):

1) JC-1（200×）在 4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以 20～25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。

2) 必須先把 JC-1（200×）用試劑盒提供的超純水充分溶解混勻后，才可以加入 JC-1 染色緩沖液（5×）。不可先配制 JC-1 染色緩沖液（1×）再加入 JC-1（200×），這樣 JC-1 會很難充分溶解，會嚴(yán)重影響后續(xù)的檢測。

3) 裝載完 JC-1 后用 JC-1 染色緩沖液（1×）洗滌時，使 JC-1 染色緩沖液（1×）保持 4℃左右，此時的洗滌效果較好。

4) JC-1 探針裝載完并洗滌后盡量在 30 分鐘內(nèi)完成后續(xù)檢測。在檢測前需冰浴保存。

5) 請勿把 JC-1 染色緩沖液（5×）全部配制成 JC-1 染色緩沖液（1×），本試劑盒使用過程中需直接使用 JC-1 染色緩沖液（5×）。

6) 如果發(fā)現(xiàn) JC-1 染色緩沖液（5×）中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，為促進(jìn)溶解可以在 37℃加熱。

7) CCCP 為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒，請注意小心防護(hù)。

8) 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

操作步驟：

1. JC-1 染色工作液的配制

六孔板每孔所需 JC-1 染色工作液的量為 1mL，其他培養(yǎng)器皿的 JC-1 染色工作液的用量以此類推；對于細(xì)胞懸液每 50～100 萬細(xì)胞需0.5mL JC-1 染色工作液。取適量 JC-1（200×），按照每 50μL JC-1（200×）加入 8mL 超純水的比例稀釋 JC-1。劇烈震蕩充分溶解并混勻 JC-1。然后再加入 2mL JC-1 染色緩沖液（5×），混勻后即為 JC-1 染色工作液。

2. 陽性對照的設(shè)置

把試劑盒中提供的 CCCP（10mM）推薦按照 1∶1000 的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，稀釋至 10μM，處理細(xì)胞 20 分鐘。隨后按照下述方法裝載 JC-1，進(jìn)行線粒體膜電位的檢測。對于大多數(shù)細(xì)胞，通常 10μM CCCP 處理 20 分鐘后線粒體的膜電位會完全喪失，JC-1 染色后觀察應(yīng)呈綠色熒光；而正常的細(xì)胞經(jīng) JC-1 染色后應(yīng)顯示紅色熒光。對于特定的細(xì)胞，CCCP 的作用濃度和作用時間可能有所不同，需自行參考相關(guān)文獻(xiàn)資料決定。

3. 對于懸浮細(xì)胞

（1） 取 10～60 萬細(xì)胞，重懸于 0.5mL 細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。

（2） 加入 0.5mL JC-1 染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中 37℃孵育 20 分鐘。

（3） 在孵育期間，按照每 1mL JC-1 染色緩沖液（5×）加入 4mL 蒸餾水的比例，配制適量的 JC-1 染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。

（4） 37℃孵育結(jié)束后，600g 4℃離心 3～4 分鐘，沉淀細(xì)胞。棄上清，注意盡量不要吸除細(xì)胞。

（5） 用 JC-1 染色緩沖液（1×）洗滌 2 次：加入 1mL JC-1 染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，600g 4℃離心 3～4 分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。再加入 1mL JC-1 染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，600g 4℃離心 3～4 分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。

（6） 再用適量 JC-1 染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計檢測或流式細(xì)胞儀分析。

4. 對于貼壁細(xì)胞

對于貼壁細(xì)胞，如果希望采用熒光分光光度計或流式細(xì)胞儀檢測，可以先收集細(xì)胞，重懸后參考懸浮細(xì)胞的檢測方法。

（1） 對于六孔板的一個孔，吸除培養(yǎng)液，根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)如有必要可以用 PBS 或其它適當(dāng)溶液洗滌細(xì)胞一次，加入 1mL 細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

（2） 加入 1mL JC-1 染色工作液，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中 37℃孵育 20 分鐘。

（3） 在孵育期間，按照每 1mL JC-1 染色緩沖液（5×）加入 4mL 蒸餾水的比例，配制適量的 JC-1 染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。

（4） 37℃孵育結(jié)束后，吸除上清，用 JC-1 染色緩沖液（1×）洗滌 2 次。

（5） 加入 2mL 細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

（6） 熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。

5. 對于純化的線粒體

（1） 把配制好的 JC-1 染色工作液再用 JC-1 染色緩沖液（1×）稀釋 5 倍。

（2） 0.9mL 5 倍稀釋的 JC-1 染色工作液中加入 0.1mL 總蛋白量為 10～100μg 純化的線粒體。

（3） 用熒光分光光度計或熒光酶標(biāo)儀檢測：混勻后直接用熒光分光光度計進(jìn)行時間掃描（time scan），激發(fā)波長為 485nm，發(fā)射波長為 590nm。如果使用熒光酶標(biāo)儀，激發(fā)波長不能設(shè)置為 485nm 時，可以在 475～520nm 范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長。另外，也可以參考下面步驟 6 中的波長設(shè)置進(jìn)行熒光檢測。

（4） 用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟 6。

6. 熒光觀測和結(jié)果分析

檢測 JC-1 單體時可以把激發(fā)光設(shè)置為 490nm，發(fā)射光設(shè)置為 530nm；檢測 JC-1 聚合物時，可以把激發(fā)光設(shè)置為 525nm，發(fā)射光設(shè)置為 590nm。

注意：此處測定熒光時不必把激發(fā)光和發(fā)射光設(shè)置在激發(fā)波長和發(fā)射波長。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測 JC-1 單體時可以參考觀察其它綠色熒光時的設(shè)置，如觀察 GFP 或 FITC 時的設(shè)置；檢測 JC-1 聚合物時可以參考觀察其它紅色熒光，如碘化丙啶或 Cy3 時的設(shè)置。出現(xiàn)綠色熒光說明線粒體膜電位下降，并且該細(xì)胞很可能處于細(xì)胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色熒光說明線粒體膜電位比較正常，細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常。