產(chǎn)品規(guī)格 （CAT#: LM1002）
Y2HGold Competent Cell: 100μl/支 保存： -80℃（3個(gè)月）
pGADT7 (control vector, 10 ng/μl) 10μl 保存：-80℃（12個(gè)月）
Carrier DNA (10 μg/μl) 100μl 保存：-20℃（12個(gè)月）
PEG/LiAC: 5ml 保存： 4℃（12個(gè)月）
Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞基因型
MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ, LYS2::GAL1UAS-Gal1TATA-His3, GAL2UAS-Gal2TATA-Ade2 URA3::MEL1UAS-Mel1TATA AUR1-C MEL1
Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞產(chǎn)品說(shuō)明
Y2HGold菌株是Clontech公司開(kāi)發(fā)的GAL4系統(tǒng)酵母雙雜實(shí)驗(yàn)用菌株，MATa型，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒或與MATα型酵母菌株Y187通過(guò)mating操作進(jìn)行蛋白互作驗(yàn)證或篩庫(kù)試驗(yàn)。Transformation marker為：trp1，leu2，報(bào)告基因?yàn)椋?em>AbAr，HIS3，ADE2，MEL1。Y2HGold-GAL4 酵母雙雜系統(tǒng)需要兩種質(zhì)粒配套使用：pGBKT7和pGADT7。質(zhì)粒pGBKT7的篩選標(biāo)志為TRP1，用于表達(dá)DNA-BD (來(lái)自酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4N端1~174位氨基酸)與目標(biāo)蛋白 (Bait)的融合蛋白；質(zhì)粒pGADT7 的篩選標(biāo)志為L(zhǎng)EU，用于表達(dá)AD(GAL4 C端768 ~881 位氨基酸)與目標(biāo)蛋白 (Prey)的融合蛋白。GAL4 系統(tǒng)原理：一個(gè)完整的酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4可分為功能上相互獨(dú)立的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：位于N端1~174位氨基酸區(qū)段的DNA結(jié)合域 (DNA-BD)和位于C端768~881 位氨基酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域 (AD)。DNA-BD能夠識(shí)別GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并與之結(jié)合。而AD可以啟動(dòng)UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。BD和AD單獨(dú)存在不能激活轉(zhuǎn)錄，但當(dāng)二者接近時(shí)，則呈現(xiàn)完整的GAL4活性，使含有UAS的啟動(dòng)子下游基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。正常條件下，BD不與AD結(jié)合，將要檢測(cè)的蛋白質(zhì)分別與BD和AD融合，形成 bait融合蛋白 (bait -BD)和 prey融合蛋白 (prey-AD)，如果 bait和 prey發(fā)生相互作用，就會(huì)促使 BD和 AD的相互接近，形成完整的GAL4，從而激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。Y2HGold有四個(gè)報(bào)告基因：AbAr，HIS3，ADE2，MEL1，分別由三種不同的啟動(dòng)子 (G1，G2，M1)啟動(dòng)，這三種啟動(dòng)子只有GAL4識(shí)別的17 bp核心區(qū)相同，其余部分均不同，大大降低了酵母雙雜假陽(yáng)性發(fā)生的概率。此外新報(bào)告基因AbAr與以前的營(yíng)養(yǎng)缺陷報(bào)告基因相比具有更低背景的優(yōu)點(diǎn)，也可以降低酵母雙雜假陽(yáng)性發(fā)生的概率。Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，-80℃可保存三個(gè)月，pGADT7質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>104cfu/μg DNA。
Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞操作方法
1. 取100 μl冰上融化的Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞，依次加入預(yù)冷的目的質(zhì)粒2-5 μg，Carrier DNA (95-100度5 min,快速冰浴，重復(fù)一次) 10 μl，PEG/LiAc 500μl并吸打幾次混勻，30度水浴30 min (15 min時(shí)翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。
2. 將管放42℃水浴15 min (7.5 min時(shí)翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。
3. 5000 rpm離心 40 s棄上清，ddH2O 400 μl 重懸，離心 30s棄上清。
4. ddH2O 50 μl重懸，涂板，29℃培養(yǎng)48-96 h。
Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞注意事項(xiàng)
1. 感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化。
2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。
3. 同時(shí)轉(zhuǎn)化2-3種質(zhì)粒時(shí)可增加質(zhì)粒的用量。
4. Y2HGold酵母菌株對(duì)高溫敏感，最適生長(zhǎng)溫度為27-30℃；高于31℃，生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。
5. 菌落變粉不是污染，是酵母細(xì)胞生長(zhǎng)中一個(gè)常見(jiàn)現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞在平板培養(yǎng)幾天后，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母試圖通過(guò)自身代謝途徑合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中間產(chǎn)物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在細(xì)胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色。
6. 酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度比YPDA培養(yǎng)基慢，培養(yǎng)基中缺陷成分越多，生長(zhǎng)越慢，以轉(zhuǎn)化涂板為例：涂YPDA平板29℃，48 h培養(yǎng)可見(jiàn)直徑1 mm克??；涂SD單缺平板29℃，48-60 h培養(yǎng)可見(jiàn)直徑1 mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80 h培養(yǎng)可見(jiàn)直徑1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90 h培養(yǎng)可見(jiàn)直徑1 mm克隆。
關(guān)鍵字： Y2HGold_感受態(tài)細(xì)胞_基因_
上海聯(lián)邁生物工程有限公司（LMAI Bio)是一家經(jīng)營(yíng)生物、儀器、試劑、耗材等科研產(chǎn)品的高新技術(shù)生命科學(xué)公司，在廣大用戶的幫助和支持下，經(jīng)過(guò)不懈的努力， 已成為國(guó)內(nèi)生命科學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)品的一家供應(yīng)商，代理許多國(guó)際先進(jìn)水平的高科技產(chǎn)品，包括分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、診 斷等多個(gè)研究及應(yīng)用領(lǐng)域。 公司的服務(wù)和業(yè)務(wù)網(wǎng)絡(luò)遍及全國(guó)，在同行獲得一致好評(píng)。 特別是生物試劑和細(xì)胞產(chǎn)品更是種類(lèi)齊全、價(jià)格實(shí)惠，美國(guó)原裝進(jìn)口原代細(xì)胞，專(zhuān)業(yè)培養(yǎng)基，常用傳統(tǒng)培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)用的相關(guān)試劑，氨基酸，抗生素，維他命類(lèi)產(chǎn)品品種齊全，試劑耗材種類(lèi)繁多。 公司的規(guī)模和產(chǎn)品種類(lèi)日益擴(kuò)大和更新，我們一直秉承著代理優(yōu)質(zhì)品牌的產(chǎn)品，服務(wù)好每一位顧客，將