凋亡因子Caspase系列檢測(cè)
一、Caspase 家族及其在細(xì)胞凋亡中的作用
Caspase全稱為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase)，是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中具有類似結(jié)構(gòu)的蛋白酶，與真核細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，并參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化與凋亡調(diào)節(jié)。Caspase是一類蛋白酶家族，根據(jù)其蛋白酶序列的同源性可分為3個(gè)亞族：Caspase-1亞族包括 Caspase-1、4、5、11；Caspase-2亞族包括Caspase-2、9； Caspase-3亞族包括Caspase-3、6、7、8、10。起細(xì)胞凋亡執(zhí)行作用的是caspase-3、6、7。Caspase又分為起始者（initiators）和執(zhí)行者（executioners）兩類，起始Caspase在外來(lái)蛋白信號(hào)的作用下被切割激活，激活的起始Caspase對(duì)執(zhí)行者Caspase進(jìn)行切割并使之激活，被激活的執(zhí)行者Caspase通過(guò)對(duì)caspase靶蛋白的水解，導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡。
1、凋亡起始者：Caspase 9、8、2、10、11；同性活化——切割自身前體
2、凋亡執(zhí)行者：Caspase 3、6、7；異性活化——切割結(jié)構(gòu)蛋白、功能蛋白
二、Caspase的檢測(cè)
嘉美實(shí)驗(yàn)有多年的檢測(cè)caspase系列酶的經(jīng)驗(yàn)。下面以檢測(cè)caspase-3酶活性為例，介紹caspase的檢測(cè)。
1、檢測(cè)原理
半胱氨酸蛋白酶caspase家族蛋白的激活是凋亡進(jìn)程中的一個(gè)必要的決定性事件。其中caspase-3的激活在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。Caspase-3正常以酶原（32KDa）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基（17KDa）和兩個(gè)小亞基（12KDa）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡?；罨腃aspase-3可以剪切特定的氨基酸序列。嘉美實(shí)驗(yàn)用具有高度特異性Caspase-3熒光底物用來(lái)檢測(cè)Caspase-3 活性。在Caspase的底物多肽(如Caspase-3的底物為DEVD)上標(biāo)記pNA (p-nitroanilide, 對(duì)硝基苯胺).當(dāng)活化的Caspase剪切標(biāo)記的底物多肽后, pNA被釋放出來(lái),此時(shí)游離的pNA的發(fā)射光譜可用分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀在400或405nm 檢測(cè),進(jìn)而推知Caspases的活性.
2、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
消毒的EP管、槍頭、三蒸水、冰、水浴箱、實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組心肌組織、超速低溫離心機(jī)、酶標(biāo)儀、721分光光度計(jì)
3、活性測(cè)定操作步驟
1）每組試劑組成
共需 2×Reaction buffer 810 ul，配制2×830ul以防不夠，用前加入8.3ul DTT
活性表示為＝樣本OD1－背景OD1（實(shí)驗(yàn)組）/樣本OD2－背景OD2（對(duì)照組）
2）操作步驟
（1）從低溫冰箱中取出用錫鉑紙包著的組織（已稱重標(biāo)記好的），取2-3塊（30mg/塊），放在EP管中，一直浸在冰水中。
（2）錫鉑紙剝?nèi)ィM織直接置于EP管中，加裂解buffer（溶后4攝氏度保存）約700ul；冰上EP管中，用小彎剪將心臟組織剪碎，越碎越好；組織、裂解buffer比例：1：10；冰上操作。
（3）開(kāi)勻漿機(jī)：取幾塊冰塊于小燒杯中，接自來(lái)水成冰水液；將EP管置于盛有冰水的小燒杯中，固定于勻漿機(jī)上；先做對(duì)照組；將轉(zhuǎn)頭插于組織液面下，打開(kāi)電源，逐漸調(diào)大速度至max，上下攪動(dòng)，直至渾濁，基本無(wú)小的組織塊為止；調(diào)小速度至零，關(guān)電源，取出轉(zhuǎn)頭，EP管放回冰水底座
用蒸餾水沖洗轉(zhuǎn)頭，液沖至廢燒杯中；依次以同樣方法將樣本組進(jìn)行勻漿。注意：放空轉(zhuǎn)，慢慢加速，別轉(zhuǎn)別上下移動(dòng)軸。
（4）勻漿后置于離心機(jī)內(nèi)：先設(shè)時(shí)間10min，“起動(dòng)”；緩慢增大離心速度至1000×10r/min；緩慢減小離心速度，降至30×10r/min時(shí)，“停機(jī)”燈亮，即可取出；注配平：套管A、B、C、D配平。
（5）取Reaction buffer 6ml，用前加入60ul DTT（稀釋100倍）；吸取上清至小EP管；依次加Reaction buffer、上清、底物至ELISA板，加底物時(shí)，每加一次換一個(gè)槍頭（因?yàn)橐靹颍?；注：底物每取完一次都要蓋蓋，避光； 加完底物后，混勻。
（6）水浴箱中孵育90min。
（7）預(yù)熱酶標(biāo)儀30min（提前半小時(shí)打開(kāi)酶標(biāo)儀）。
（8）酶標(biāo)儀上讀取OD值（405nm處測(cè)）。
3）測(cè)蛋白
（1）需準(zhǔn)備考馬斯亮蘭試劑盒
（2）用剩余的血清測(cè)蛋白
（3）樣本管：每管2.1ml考馬斯亮蘭＋35ul血清 （考馬斯亮蘭原液5ul，5倍稀釋）；空白管：2.1ml考馬斯亮蘭。
（4）開(kāi)蓋調(diào)零，關(guān)蓋調(diào)百，595nm處測(cè)定
4）注意事項(xiàng)
（1）提前計(jì)算所需Reaction buffer的量，然后用前加入DTT（稀釋100倍）。
（2）DEVD-pNA要避光保存。
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