4-香豆酸：輔酶 A 連接酶（ 4-coumarate:CoA ligase，4CL)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100 管/48 樣 

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

4CL 是連接苯丙酸途徑與木質(zhì)素特異合成途徑的關(guān)鍵酶，主要催化肉桂酸生成相應(yīng)的肉桂酸輔酶 A 酯，是合成木質(zhì)素與其他苯丙烷類化合物的代謝流向調(diào)控點(diǎn)。該酶主要存在于高等植物、酵母和菌類中， 研究該酶可以探討多種生物細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中木質(zhì)素沉積的代謝機(jī)理，為減少水果石細(xì)胞含量而提高其品質(zhì) 提供依據(jù)。 

測(cè)定原理：

4CL 催化 4-香豆酸和 CoA 生成 4-香豆酸 CoA，在 333nm 下測(cè) 4-香豆酸 CoA 生成速率，即可反映 4CL 活性。

需自備的儀器和用品： 

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、研缽、 冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?nbsp;

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞： 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml） 為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 

組織： 按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液）， 進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀 40℃預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 333nm，蒸餾水調(diào)零。 準(zhǔn)備 96 孔 UV 板一塊（非普通酶標(biāo)板，普通酶標(biāo)板只能透過(guò)可見(jiàn)光，不能透過(guò)紫外光，檢測(cè)波長(zhǎng)小 于 340nm 務(wù)必使用 UV 板）。 

2、樣本測(cè)定 

（1）在試劑二中加入 5ml 試劑一充分溶解混勻，置于 40℃水浴預(yù)熱 10min；現(xiàn)配現(xiàn)用（配好后 24h 內(nèi)用完）； 

（2）對(duì)照管：在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中加入 10μl 樣本和 190μl 試劑一，混勻，立即記錄 333nm 處 40℃反應(yīng) 30min 后的吸光值 A1。 （3）測(cè)定管：在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中加入 10μl 樣本和 190μl 試劑二，混勻，立即記錄 333nm 處 40℃反應(yīng) 30min 后的吸光值 A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。