中文名：Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒
英文名：Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit
貨號(hào)：A266226
包裝：100t、20t、50t
存儲(chǔ)溫度：2-8°C儲(chǔ)存,避光,干燥
產(chǎn)品介紹：
產(chǎn)品介紹
磷脂酰絲氨酸（PS）是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常細(xì)胞中，PS只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向細(xì)胞膜外側(cè)，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被公認(rèn)為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。
將Annexin V進(jìn)行綠色熒光（FITC）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V作為探針，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但對(duì)凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此采用Annexin V與PI雙染的方法，就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開來。
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 圖1.?細(xì)胞凋亡過程中磷脂酰絲氨酸（PS）外翻示意圖
試劑盒組份
Reagents | 20 assays | 50 assays | 100 assays | Storage |
Annexin V-FITC | 100 μl | 250 μl | 500 μl | 4°C Protect from light |
Propidium Iodide, PI | 200 μl | 500 μl | 1000 μl | 4°C Protect from light |
Binding Buffer ( 4X ) | 4 ml | 10 ml | 20 ml | 4° |
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產(chǎn)品參數(shù)
Ex(nm)：490 ????Em(nm)：520
?所需實(shí)驗(yàn)器材?
微量移液器；PBS；不含EDTA的胰酶消化液；低速離心機(jī)；流式細(xì)胞儀
注意事項(xiàng)?
1.??此試劑盒僅供研究使用。
2.??微量試劑需離心數(shù)秒將試劑收集至管底后再開蓋取用。
3.??Propidium Iodide（PI）有毒，操作時(shí)要帶手套，使用時(shí)避免與皮膚，眼睛和黏膜接觸。
4.??Annexin V-FITC中含有劇毒成分疊氮化鈉（NaN3）,?操作時(shí)要帶手套，使用時(shí)避免與皮膚，眼睛和黏膜接觸。
5. 本試劑盒用于檢測(cè)活細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，細(xì)胞數(shù)量不應(yīng)低于1x10^6。
6.??染色后宜盡快檢測(cè)，時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致凋亡或壞死細(xì)胞的數(shù)量增加。
7.??Annixin V檢測(cè)凋亡細(xì)胞的方法適用于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，如：淋巴細(xì)胞等細(xì)胞的檢測(cè)。對(duì)于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，由于在胰酶等消化處理過程中會(huì)造成細(xì)胞膜的損傷，會(huì)造成較高的假陽性，而用細(xì)胞刮子會(huì)造成細(xì)胞粘連成團(tuán)，而影響檢測(cè)，可將胰酶消化后的細(xì)胞保存在含2%BSA的PBS中，防止進(jìn)一步的損傷。盡管目前，包括國(guó)外也有一些單位采用該方法檢測(cè)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。
8.??消化貼壁細(xì)胞殘留的胰酶會(huì)消化并降解Annexin V-FITC，最終導(dǎo)致染色失敗。
9.??細(xì)胞固定后可能導(dǎo)致熒光的淬滅，請(qǐng)不要固定樣品。
操作說明：
1. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：
a) 懸浮細(xì)胞：
1）收集細(xì)胞?離?管中 1000-2000rpm 離? 5min，??去除上清。
2）? 1ml 4℃預(yù)冷 PBS 輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，1000-2000rpm 離? 5min，??吸除上清。
3）再加? 1ml 4℃預(yù)冷的 PBS 重懸細(xì)胞，1000-2000rpm 離? 5min，??吸除上清。
b) 貼壁細(xì)胞：
1）吸出細(xì)胞培養(yǎng)液?離?管中，PBS 洗滌貼壁細(xì)胞?次，加?適量不含 EDTA 的胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞。
2）室溫孵育?輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來時(shí)，吸除胰酶細(xì)胞消化液。需避免胰酶的過度消化。
3）加?以上步驟中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離?管內(nèi)，1000-2000rpm 離? 5min，??吸除上清。
注：加?的細(xì)胞培養(yǎng)液???可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)?凋亡或壞死的細(xì)胞，另???細(xì)胞培養(yǎng)液中的?清可以有效抑制或中
和殘留的胰酶；殘留的胰酶會(huì)消化并降解后續(xù)加?的 Annexin V-FITC 導(dǎo)致染?失敗。
4）? 1ml 4℃預(yù)冷 PBS 輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，1000-2000rpm 離? 5min，??吸除上清。
5）再加? 1ml 4℃預(yù)冷的 PBS 重懸細(xì)胞，1000-2000rpm 離? 5min，??吸除上清。
2. ?去離??按 1：4 稀釋 Binding Buffer（4ml Binding Buffer+12ml 去離??）；
3. 用 250μl 結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為 1×106
/ml；
4. 取 100μl 的細(xì)胞懸液于 5 ml 流式管中，加入 5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻；
5. 室溫(20-25℃)避光孵育 10min；
6. 上機(jī)前 5min 加? 10μl 碘化丙啶溶液，輕輕混勻；
7. 上機(jī)前在反應(yīng)管中補(bǔ)加 400μl PBS 重懸細(xì)胞， 避光保存，隨即進(jìn)?流式細(xì)胞儀（FACS）檢測(cè)， Annexin V-FITC 為綠?熒光，PI 為紅?熒光。
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