細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Annexin V-FITC/PI)

中文名稱：細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Annexin V-FITC/PI)

英文名稱：Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit

產(chǎn)品規(guī)格：20T|50T|100T

本試劑盒是用FITC標(biāo)記的Annexin V作為探針，來檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的發(fā)生。可用于流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。

其檢測(cè)原理為：在正常的活細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細(xì)胞中，PS從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36kDa的Ca²⁺依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合，可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。

另外，本試劑盒中還提供了碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）用來區(qū)分存活的早期細(xì)胞和壞死或晚期凋亡細(xì)胞。PI是一種核酸染料，它不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但可以透過凋亡晚期和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此，將Annexin V與PI聯(lián)合使用時(shí)，PI則被排除在活細(xì)胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細(xì)胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時(shí)被FITC和PI結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽(yáng)性（Annexin V+/PI+）。

試劑盒組成：
 

保存條件：-20℃避光長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融，一年有效。

注意事項(xiàng)：
1．由于細(xì)胞凋亡是一個(gè)快速的過程，建議樣品在染色后1小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行分析。
2．對(duì)于貼壁細(xì)胞，消化是一個(gè)關(guān)鍵步驟。貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)如有漂浮細(xì)胞，需收集漂浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞后合并染色。處理貼壁細(xì)胞時(shí)要小心操作，盡量避免人為的損傷。胰酶消化時(shí)間過短，細(xì)胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細(xì)胞膜的損傷；PI攝入過多，消化時(shí)間過長(zhǎng)，細(xì)胞膜同樣易造成損傷，甚至?xí)绊懠?xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-FITC的結(jié)合。消化時(shí)將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖使胰酶與細(xì)胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余少量胰酶再消化一段時(shí)間，待細(xì)胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用EDTA，EDTA會(huì)影響Annexin V與PS的結(jié)合。
3．實(shí)驗(yàn)中如需要固定細(xì)胞，比如在檢測(cè)凋亡的同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞周期，只能選用Annexin V-FITC，而不能選用Annexin V-EGFP，因?yàn)樵诠潭ㄟ^程中EGFP會(huì)變性導(dǎo)致喪失激發(fā)熒光的能力。固定前需要先將細(xì)胞與Annexin V-FITC進(jìn)行孵育，并用Binding buffer洗掉未結(jié)合的Annexin V-FITC。因?yàn)楣潭ㄟ^程中細(xì)胞通透性增加會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞碎片，可以和Annexin V結(jié)合，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾。
4．如果樣品來源于血液，請(qǐng)務(wù)必除去血液中的血小板。因?yàn)檠“搴蠵S，能與Annexin V結(jié)合，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？梢允褂煤蠩DTA的緩沖劑并在200g離心洗去血小板。
5．試劑在開蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時(shí)液體灑落。
6．Annexin V-FITC和PI是光敏物質(zhì)，在操作時(shí)請(qǐng)注意避光。

操作方法：

一、樣品染色

1．收集細(xì)胞
  懸浮細(xì)胞：300g，4℃離心5min收集細(xì)胞。
  貼壁細(xì)胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300g，4℃離心5min收集細(xì)胞。胰酶消化時(shí)間不宜過長(zhǎng)，以防引起假陽(yáng)性。
2．用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次均需300g，4℃離心5min。收集1～5×10⁵細(xì)胞。
3．吸棄PBS，加入100μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞。
4．加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI Staining Solution，輕輕混勻。
5．避光、室溫反應(yīng)10-15min。
6．加入400μL 1×Binding Buffer，混勻后放置于冰上，樣品在1小時(shí)內(nèi)用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測(cè)。
  注意：為了避免洗滌細(xì)胞時(shí)損失細(xì)胞，在吸液時(shí)可以用大的Tip頭套上小的Tip頭吸液。

二、樣品分析

A．流式細(xì)胞儀分析：
  FITC激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射波長(zhǎng)525nm，F(xiàn)ITC的綠色熒光在FL1通道檢測(cè)；PI-DNA復(fù)合物的激發(fā)波長(zhǎng)為535nm，發(fā)射波長(zhǎng)為615nm，PI的紅色熒光在FL2或FL3通道檢測(cè)。用CellQuest等軟件進(jìn)行分析，繪制雙色散點(diǎn)圖（two-color dot plot），F(xiàn)ITC為橫坐標(biāo)，PI為縱坐標(biāo)。典型的實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞可以分成三個(gè)亞群，活細(xì)胞僅有很低強(qiáng)度的背景熒光，早期凋亡細(xì)胞僅有較強(qiáng)的綠色熒光，晚期凋亡細(xì)胞有綠色和紅色熒光雙重染色。

B．熒光顯微鏡分析：
1．滴一滴用Annexin V-FITC/PI雙染的細(xì)胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細(xì)胞。
  注意：對(duì)于貼壁細(xì)胞，可直接用蓋玻片培養(yǎng)細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
2．在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。Annexin V-FITC熒光信號(hào)呈綠色，PI熒光信號(hào)呈紅色。

特別提示：本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！