貨號(hào) | 名稱 | 規(guī)格 | 價(jià)格 |
M2150 | Puromycin Dihydrochloride嘌呤霉素鹽酸鹽 | 25mg | 678 |
M2350 | Puromycin Dihydrochloride嘌呤霉素鹽酸鹽 | 100mg | 2078 |
M2750 | Puromycin Dihydrochloride嘌呤霉素鹽酸鹽 | 500mg | 8558 |
產(chǎn)品介紹:
嘌呤霉素(Puromycin)是由白黑鏈霉菌(Streptomyces alboniger)發(fā)酵代謝產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素,通過抑制蛋白質(zhì)合成而殺死革蘭氏陽性菌,各種動(dòng)物和昆蟲細(xì)胞。某種特殊情況下有效作用大腸桿菌。作用機(jī)制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3′末端的類似物,能夠與核糖體的A位點(diǎn)結(jié)合并摻入到延伸的肽鏈中。嘌呤霉素同A位點(diǎn)結(jié)合后,不會(huì)參與隨后的任何反應(yīng),從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的提前終止并釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。
嘌呤霉素產(chǎn)生菌Streptomyces alboniger內(nèi)發(fā)現(xiàn)的pac基因編碼嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAC),賦予機(jī)體對嘌呤霉素產(chǎn)生抗性。這一特性如今普遍應(yīng)用于篩選特定攜帶pac基因質(zhì)粒的哺乳動(dòng)物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。
嘌呤霉素在細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選中的普遍應(yīng)用與慢病毒載體的特性有關(guān),現(xiàn)在商業(yè)化的慢病毒載體多數(shù)都攜帶pac基因。在某些特定情況下,嘌呤霉素亦可以用來篩選轉(zhuǎn)化攜帶pac基因質(zhì)粒的大腸桿菌菌株。
產(chǎn)品性質(zhì)
CAS號(hào)(CAS NO.) 58-58-2
分子式(Formula) C22H29N7O5·2HCl
分子量(Molecular weight) 544.43 g/mol
純度(Purity, HPLC) >98%
外觀(Appearance) 白色至米白色粉末
運(yùn)輸和保存方法
冰袋運(yùn)輸。-20℃干燥保存,2年有效。
使用方法
1. 建議使用濃度
哺乳動(dòng)物細(xì)胞:1-10 μg/mL,濃度需要?dú)缜€來確定。
大腸桿菌:LB瓊脂培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化pac基因的大腸桿菌,使用濃度為125 μg/mL。
【注】:使用嘌呤霉素篩選大腸桿菌穩(wěn)轉(zhuǎn)株需要精確的pH值調(diào)節(jié),而且受宿主細(xì)胞本身的影響。
2. 溶解方法
用蒸餾水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/mL的母液,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌后分裝于-20℃凍存;也可溶于甲醇,配制成10 mg/mL的儲(chǔ)存液。
3. 嘌呤霉素殺滅曲線的確定(以shRNA轉(zhuǎn)染或者慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)為例)
嘌呤霉素有效篩選濃度跟細(xì)胞類型、生長狀態(tài)、細(xì)胞密度、細(xì)胞代謝情況及細(xì)胞所處細(xì)胞周期位置等有關(guān)。為了篩選到穩(wěn)定表達(dá)的shRNA細(xì)胞株,確定殺死未轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的最低濃度嘌呤霉素至關(guān)重要。建議初次做實(shí)驗(yàn)的客戶一定要建立適合自身實(shí)驗(yàn)體系的殺死曲線(kill curve)。
1)Day 1:24孔板內(nèi)以5~8×104 cells/孔的密度鋪板,鋪?zhàn)銐蛄康目滓赃M(jìn)行后續(xù)的梯度實(shí)驗(yàn)。37℃細(xì)胞孵育過夜。
2)Day 2:①準(zhǔn)備篩選培養(yǎng)基:含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基(如0-15 μg/mL,至少5個(gè)梯度);②往孵育過夜后的細(xì)胞內(nèi)更換新鮮配制的篩選培養(yǎng)基;之后37℃孵育細(xì)胞。
3)Day 4:更換新鮮的篩選培養(yǎng)基,并觀察細(xì)胞存活率。
4)根據(jù)細(xì)胞的生長狀態(tài),約2-3天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基。
5)每日監(jiān)測細(xì)胞,觀察存活細(xì)胞率,從而確定抗生素篩選開始4-6天內(nèi)有效殺死非轉(zhuǎn)染或所有非轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的藥物最低濃度。
4. 哺乳動(dòng)物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選
等轉(zhuǎn)染含有pac基因的質(zhì)粒后,細(xì)胞在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中增殖,以篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。
1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,將細(xì)胞(原樣或稀釋)置于含有適當(dāng)濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
注:當(dāng)細(xì)胞處于分裂活躍期時(shí),抗生素作用最明顯。細(xì)胞過于密集,抗生素產(chǎn)生的效力會(huì)明顯下降。進(jìn)行細(xì)胞分盤使其密度 不超過25%。
2)每隔2-3天,移除和更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基。
3)篩選7天后評估細(xì)胞形成的病灶。病灶可能需要額外的一周或者更多時(shí)間,這依賴于宿主細(xì)胞系和轉(zhuǎn)染篩選效率。
注:每日進(jìn)行細(xì)胞生長狀態(tài)的觀察。嘌呤霉素的篩選至少需要48 h,有效濃度嘌呤霉素的篩選周期一般在3-10天。
4)轉(zhuǎn)移和放置5-10個(gè)抗性克隆到一個(gè)35 mm的培養(yǎng)皿中,用選擇培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7天。此次富集培養(yǎng)是為日后的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。
注意事項(xiàng)
1)嘌呤霉素為有毒化合物,操作時(shí)請小心拿放。
2)為了您的安全和健康,請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
關(guān)鍵字: 58-58-2,Puromycin Di;
南京沃博生物科技有限公司是一家集研發(fā)、生產(chǎn)、銷售為一體的高新技術(shù)企業(yè)。沃博生物專注于生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域, 致力于為客戶提供一系列高質(zhì)量和有絕對價(jià)格競爭力的產(chǎn)品,包括分子生物學(xué)、免疫學(xué)、生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)的試劑、試劑盒, 并提供一系列相關(guān)的技術(shù)服務(wù)。