蛋白酶K的應用主要為核酸提取時去除DNA酶和RNA酶，并且可將結合于基因組上的組蛋白去除，還可用于堿性磷酸酶的失活。目前分子生物學技術已應用于許多檢測標準中，例如轉基因檢測、動物屬性檢測、致病微生物檢測等。在分子生物學檢測中核酸的提取質量直接影響了后續(xù)PCR反應的擴增效率。許多標準在核酸提取步驟中都設立了添加蛋白酶K消化的步驟，以期提取較純的核酸。為了保護核酸，分子生物學核酸提取實驗中通常含有EDTA等試劑，由于EDTA可以與金屬離子絡合，因此可能會導致酶活性受到影響；并且通常為pH8.0時和55℃條件下進行消化，不同pH值和溫度條件會使得酶活性受到影響。

分離DNA和RNA期間使核苷酸酶蛋白失活。去除內毒素對陽離子蛋白的約束，如溶菌酶和核糖核酸酶。研究報告顯示用于分離肝，酵母，綠豆線粒體測定細胞膜上的酶用于抗體標記，石蠟包埋組織切片中暴露抗原結合位點。消化腦組織樣本中的蛋白質，用于朊病毒的傳染性海綿狀腦病（TSE）的研究