幾丁質(zhì)酶（Chitinase）試劑盒說(shuō)明書(shū)
分光光度法50管/24樣
注 意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
幾丁質(zhì)酶（Chitinase）試劑盒測(cè)定意義：
幾丁質(zhì)主要存在于蝦、蟹、昆蟲(chóng)等甲殼類(lèi)動(dòng)物的外殼與軟體動(dòng)物的器官(例如烏賊的軟骨)，以及真菌類(lèi)的細(xì)胞壁中。而幾丁質(zhì)酶(EC 3.2.1.14)可催化幾丁質(zhì)水解，具有抵御真菌侵染的作用，成為抗真菌病害的研究熱點(diǎn)。
測(cè)定原理：
幾丁質(zhì)酶水解幾丁質(zhì)產(chǎn)生N-乙酰氨基葡萄糖，進(jìn)一步與對(duì)二甲氨基苯甲醛產(chǎn)生紅色化合物，在585nm處有特征吸收峰，吸光值增加速率反映了幾丁質(zhì)酶的活性。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
天平、水浴鍋、離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)、1 mL玻璃比色皿，蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體10mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體10mL×1瓶，4℃保存。（若出現(xiàn)結(jié)晶，可80℃左右加熱溶解后使用）
試劑三：液體10mL×1瓶，4℃保存。
試劑四：液體20mL×1瓶，4℃避光保存。
粗酶液提取：
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃離心20min，取上清，置冰上待測(cè)。
2. 真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃，離心20min，取上清置于冰上待測(cè)。
3. 培養(yǎng)液：直接測(cè)定。
幾丁質(zhì)酶（Chitinase）試劑盒測(cè)定操作表：
| 對(duì)照管 | 測(cè)定管 |
粗酶液（μL） | 400 | 400 |
提取液（μL） | 600 | 200 |
試劑一（μL） |
| 400 |
混勻，37℃水浴1h |
試劑二（μL） | 200 | 200 |
混勻，沸水浴7min，5000rpm，4℃，離心10min，取上清1000μL。 |
試劑三（μL） | 200 | 200 |
試劑四（μL） | 400 | 400 |
混勻，37℃，15min，蒸餾水調(diào)零，1mL玻璃比色皿，測(cè)定A585，ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照。 |
計(jì)算公式：
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.3088-0.003，R2=0.9995
計(jì)算公式：
1、 按照樣本重量計(jì)算
酶活性定義：37℃條件下，每克組織每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活性單位。
幾丁質(zhì)酶活性（mg/h/g鮮重）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反總÷(V樣÷V樣總×W) ÷T
=8.096×（ΔA +0.003）÷W
2、 按照蛋白質(zhì)濃度計(jì)算
酶活定義：37℃條件下，每毫克蛋白每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活單位。
幾丁質(zhì)酶活性（mg/h mg prot）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T
= 8.096×（ΔA +0.003）÷Cpr
3、 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活定義：37℃條件下，每104個(gè)細(xì)胞每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活單位。
幾丁質(zhì)酶活性（mg/h /104 cell）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反總÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)
=8.096×（ΔA +0.003）÷細(xì)胞數(shù)量
4、按液體體積計(jì)算
酶活定義：37℃條件下，每毫升培養(yǎng)液每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活單位。
幾丁質(zhì)酶活性（mg/h /mL）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反總÷V樣=8.096×（ΔA +0.003）
V反總：反應(yīng)體系總體積，1mL；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.4mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL
注意事項(xiàng)：
1、 反應(yīng)結(jié)束后立即進(jìn)行比色。
2、 試劑四有一定的毒性，請(qǐng)操作時(shí)做好防護(hù)措施。
關(guān)鍵字： 還原糖含量試幾丁質(zhì)酶（Chitina劑盒;幾丁質(zhì)酶（Chitinase）試劑盒;
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