α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Arabinofuranosidase, α-L-Af）

試劑盒說明書

                              分光光度法50管/24樣

注   意 ：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Arabinofuranosidase, α-L-Af） 試劑盒測定意義：                           

α-L-Af 是一種能夠水解非還原呋喃阿拉伯糖殘基的糖苷酶類，使細(xì)胞壁阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯甘露聚糖等中性糖不斷解離，促進(jìn)果膠的增溶和降解。由于果實成熟過程中常常伴隨著阿拉伯糖的喪失，該酶活性在果實成熟軟化中的研究具有重大意義。

測定原理：

α-L-Af分解對硝基酚阿拉伯呋喃糖苷生成對-硝基苯酚，后者在400nm有吸收峰，通過測定吸光值升高速率來計算α-L-Af活性。

自備用品：

可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入5mL蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。

試劑二：液體15mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體50mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Arabinofuranosidase, α-L-Af） 試劑盒測定步驟：

1、 分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至400nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定（在EP管中依次加入下列試劑）：

迅速混勻，放入37℃準(zhǔn)確水浴30min

充分混勻，400nm處測定吸光值A，計算ΔA=A測定-A對照。每個測定管需設(shè)一個對照管。

α-L-Af活性計算：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y =0.00585x -0.0027；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL），y為吸光值。

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每min產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。

α-L-Af活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T

=39.89×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每小時產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。

α-L-Af活性(nmol/min/g鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=39.89×(ΔA+0.0027) ÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每小時產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。

α-L-Af活性(nmol/min/10⁴cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)÷T

=0.08×(ΔA +0.0027)

Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.5mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬；T：反應(yīng)時間，30min。