腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGP）活性測定試劑盒說明書

                                     
                                                                       分光光度法 25管/24樣

注    意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中，催化葡萄糖-1-磷酸與ATP反應生成淀粉合成的直接前體ADPG，是植物淀粉生物合成的主要限速步驟。

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGP）活性測定試劑盒測定原理：

AGP催化的逆向反應生成G1P，在反應體系中添加的磷酸己糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，340nm下測定NADPH增加速率，即可計算AGP活性。

需自備的的儀器和用品：

紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1 mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水

試劑的組成和配制：

提取液：液體25mL×1瓶，4℃保存;

試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入9mL蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入5mL蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

粗酶液制備：

按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGP）活性測定試劑盒測定步驟：

1、分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至340nm，蒸餾水調零。

2、試劑一置30℃保溫10min以上。

3、在EP管中按順序加入下列試劑

混勻，30℃保溫15 min，置沸水浴中1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴迅速冷卻后，4000g4℃離心5min，取上清液，在1mL石英比色皿中依次加入下列試劑

混勻后，立即于340 nm波長下記錄初始吸光度A1和 2min后的吸光度A2，計算ΔA=A2-A1。

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGP）活性測定試劑盒AGP活性計算：

1、按樣本蛋白蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個酶活性單位。

AGP（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T×稀釋倍數(shù)

                =2813×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2、按照樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

AGP（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V樣÷V樣總）÷T×稀釋倍數(shù)

                =2813×ΔA÷W

V反總：反應體系總體積，1×10^-3 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.04mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，2 min；稀釋倍數(shù)：1.4；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量。

一．試劑配制

1、標準溶液

鹽酸標準溶液[c (HCl)=0.1000 mol/L]，移取9 mL 濃鹽酸（鹽酸濃度36%～38%）用蒸餾水稀釋并定容至1000 mL容量瓶，搖勻，用無水碳酸鈉進行標定。

無水碳酸鈉標定方法：取50mL蒸餾水，加入10滴溴甲酚綠-甲基紅混合指示劑，用配置好的鹽酸溶液滴定至溶液由變?yōu)榘导t色，消耗鹽酸體積記為V₀；再準確稱取經(jīng)300℃烘干1小時的無水碳酸鈉0.2g，精確至0.0001，記為m，溶于少量蒸餾水中定容至50mL，加入10滴溴甲酚綠-甲基紅混合指示劑，用配置好的鹽酸溶液滴定至溶液由綠色變?yōu)榘导t色，煮沸3分鐘，冷卻后繼續(xù)滴定至溶液呈暗紅色，消耗鹽酸體積記為V。

C（HCl）=m/[(V-V₀)*0.05299],其中C（HCl）單位為mol/L。

2、40%氫氧化鈉溶液1000 ml（400 g/L）

400g氫氧化鈉溶解于1000mL無氨蒸餾水中；

3、2%濃度硼酸溶液2000 ml （20g/L）

分析純硼酸40g溶于2000ml無氨蒸餾水中；

4、甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑

A：稱取0.1g 甲基紅，用無水乙醇定容至100 ml；

B：稱取0.1g 溴甲酚綠，用無水乙醇定容至100 ml.

臨用時按照A:B=1:5混勻。取10ml加入1000ml硼酸溶液中。

5、高錳酸鉀溶液：2.5g高錳酸鉀溶于50mL蒸餾水中。

6、1:1硫酸溶液：100mL濃硫酸緩慢加入100ml蒸餾水中，邊加邊攪拌。

二．樣品消解

1. 將植物樣本粉碎，80℃烘干至恒重，過40目篩，稱取約0.3g，加入消化管中，同時取空消化管兩支，用移液管分別往每管中加入10mL濃硫酸，輕輕晃動消化管。

2. 將20支消化管全部置于石墨消解儀上，蓋好蓋子，打開廢氣回收系統(tǒng)以及石墨消解儀，溫度設置為：曲線加熱100℃，10min；280℃，10min；400℃，40min。

3. 取出消化管冷卻至室溫，切勿在樣品冷卻之前開蓋。每支消化管中緩慢加入1mL過氧化氫，搖勻，重新

放置在石墨消解儀上，溫度設置為：曲線加熱200℃，10min；320℃，30min；400℃，30min。

4. 取出消化管冷卻至室溫，切勿在樣品冷卻之前開蓋。每支消化管中緩慢加入0.5mL過氧化氫，搖勻，重新放置在石墨消解儀上，溫度設置為：曲線加熱200℃，10min；320℃，30min；400℃，60min。若樣本未呈現(xiàn)澄清狀態(tài)，應繼續(xù)加熱至澄清，即消解完全。

5. 關閉石墨消解儀，待樣品冷卻后關掉廢氣回收系統(tǒng)。

三．全氮測定

1. 將滴定酸桶，硼酸桶，堿桶，蒸餾水桶管路按照標示插好（滴定酸桶的管子應插到底部），將硼酸桶，堿桶，蒸餾水桶的液位檢測插好。

2. 打開定氮儀與循環(huán)水系統(tǒng)，進入清洗界面，先進行兩次硼酸清洗管路，再進行一次換酸清洗，一次堿管路清洗。

3. 裝一只空的消化管，關好防護門。點擊【測試】菜單系統(tǒng)自動進入操作模式界面，選擇【自動測試】，常規(guī)，設置參數(shù)為：樣品編號；樣品重量：0.000g。滴定酸濃度：標定好的鹽酸濃度(mol/L)；空白值：0.000mL；蛋白系數(shù)：樣品固定的轉換系數(shù)。硼酸：15ml；稀釋水：20mL；堿液：0mL；蒸餾：5min；設置完成后，點擊【確定】即可進入自動測試功能。

4. 測試完成后打印測定結果。

5. 打開安全門，戴棉質手套取出消化管，放入樣品空白管，關好防護門。點擊【測試】菜單系統(tǒng)自動進入操作模式界面，選擇【自動測試】，常規(guī)，堿液參數(shù)設置為40mL，其余參數(shù)同步驟3，重復步驟3。

6. 樣品測定：設置參數(shù)為：樣品編號；樣品重量：稱取的樣品實際質量，g。滴定酸濃度：標定好的鹽酸濃度(mol/L)；空白值：兩支空白管滴定用酸量的平均值，mL；蛋白系數(shù)：樣品固定的轉換系數(shù)。硼酸：15ml；稀釋水：20mL；堿液：40mL；蒸餾：5min；設置完成后，點擊【確定】即可進入自動測試功能。

7. 測試完成后打印測定結果。

8. 進行儀器清洗，然后關閉循環(huán)水系統(tǒng)及定氮儀，然后清潔儀器。

四．注意事項

1. 禁止使用邊緣有缺口，或者有裂縫的消化管進行消解，消解時蓋子放置好，以免廢氣泄露，消解儀工作狀態(tài)盡量不要靠近儀器，但是要經(jīng)常觀察管內變化，若出現(xiàn)異常情況，立即斷電。

2. 開始蒸餾時，消化管中液體的總體積以不超過總體積的1/3。

3. 拿取消化管時，注意高溫燙傷。放置消化管時，左右旋轉幾下，確保消化管與蒸餾頭密封。

4. 每日做完實驗要用洗瓶沖洗蒸餾頭殘余堿液，儀器前部的槽皿中，如果積有液體，請擦洗干凈。

5. 為了延長防濺裝置的使用壽命，請每天工作結束后清洗兩次左右：即消化管加水150mL空蒸5分鐘。（空蒸儀器把加堿量設置為“0”）。

6. 關機前，需將接收杯內液體排凈，儀器使用結束后要關閉水源、電源，儀器上要放置一空消化管（防止防濺裝置內殘留液體流到儀器上）。

7. 做完實驗將消解管清洗干凈（包括壁內和壁外），然后放烘箱烘干，烘干后若長時不用則收起來。消解儀各部位上若有硫酸殘留需及時擦拭干凈一面被腐蝕，消解儀蓋子以及托盤需長清洗保持潔凈。