苯胺-4-羥化酶（AH）試劑盒說明書
分光光度法 50管/24樣
注 意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
細(xì)胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用，尤其是藥物和毒物的代謝。AH在P450酶系中相當(dāng)于CYP2E1亞型，CYP2E1不僅參與了藥物的代謝，而且還能催化多種前致癌物和前毒物的活化過程。
苯胺-4-羥化酶（AH）試劑盒測定原理：
AH催化苯胺羥化后產(chǎn)生的4-氨基酚，進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)榉?/span>-吲哚復(fù)合物，在630nm處有特征吸收峰；通過測定630nm吸光度增加速率，來計算AH活性。
自備儀器及用品：
可見分光光度計、普通離心機(jī)、超速離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、1mL玻璃比色皿、雙蒸水和冰。
試劑組成和配制：
試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入50 mL蒸餾水，充分溶解。
試劑二：液體×1瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入26 mL蒸餾水，充分溶解。
試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入13 mL蒸餾水，充分溶解。
試劑五：液體×1瓶，4℃保存。
試劑六：粉劑×1瓶（腐蝕性試劑），4℃避光保存。臨用前加入26 mL蒸餾水，充分溶解。
試劑七：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入26 mL蒸餾水充分溶解。
標(biāo)準(zhǔn)液：液體×1瓶，10μmol/L，4℃避光保存。
粗酶液提?。?/span>
1、除去細(xì)胞核，線粒體等大分子物質(zhì)：稱約0.5g組織，加入1mL試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃，離心30min，取上清液，轉(zhuǎn)移到超速離心管中。
2、粗制微粒體： 100 000g 4℃，離心60min，棄上清液。
3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟2的沉淀中加1mL試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g離心30min，棄上清液。
4、最終微粒體：向步驟3的沉淀中加試劑二0.5mL，蓋緊后充分震蕩溶解，即粗酶液，待測。
苯胺-4-羥化酶（AH）試劑盒測定操作：
1. 分光光度計預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到630 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑三置于37℃水浴中預(yù)熱30min。
3. 試劑五置于冰浴預(yù)冷30min。
4. 標(biāo)準(zhǔn)管：取1.5 mL EP管，加入500μL 標(biāo)準(zhǔn)液，500μL試劑六，500μL試劑七，混勻后室溫靜置30min，于630 nm測定光吸收，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。
5. 對照管：取1支1.5 mL EP管，加入250μL粗酶液，500μL試劑三，250μL蒸餾水，混勻后37℃水浴中保溫30min；再加入500μL試劑五，混勻后冰浴5min，11000rpm，4℃，離心10min；取500μL上清液，
加入1支新的1.5 mL EP管；再加入500μL試劑六，500μL試劑七，混勻后室溫靜置30min，于630 nm測定光吸收，記為A對照管。
6. 測定管：取1支1.5 mL EP管，加入250μL粗酶液，500μL試劑三，250μL試劑四，混勻后37℃水浴中保溫30min；再加入500μL試劑五，混勻后冰浴5min，11000rpm，4℃，離心10min；取500μL上清液，加入1支新的1.5 mL EP管；再加入500μL試劑六，500μL試劑七，混勻后室溫靜置30min，于630 nm測定光吸收，記為A測定管。
苯胺-4-羥化酶（AH）試劑盒AH活性計算公式：
(1) 按照蛋白濃度計算:
活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 4-氨基酚為1個酶活單位。
AH活性(nmol/min/mg prot) = C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×（A測定管－A對照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T
= 2×（A測定管－A對照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr
(2) 按照樣本質(zhì)量計算:
活性單位定義：37℃中每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 4-氨基酚為1個酶活單位。
AH活性(nmol/min/g 鮮重)= C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×（A測定管－A對照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷(W×V樣)÷T
= 2×（A測定管－A對照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷W
C標(biāo)準(zhǔn)品：10μmol/L；V標(biāo)準(zhǔn)品：500μL=0.0005L；稀釋倍數(shù)：V反總÷V上清液=1500μL÷500μL=3；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；V樣：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積，250μL=0.25 mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，30min。
關(guān)鍵字： 苯胺-4-羥化酶（AH）試劑盒;苯胺-4-羥化酶（AH）試劑盒;
上海雅吉生物科技有限公司成立于2011年3月，是一家面向生命科學(xué)領(lǐng)域，提供科研類試劑、耗材、儀器、技術(shù)服務(wù)的生物企業(yè)。包括分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)等 。旗下?lián)碛?“雅吉生物”、“晶風(fēng)生物”、“彩佑實業(yè)”、“GTX” 品牌。通過公司各部門員工的共同努力在行業(yè)內(nèi)擁有較高知名度，深得新老客戶厚愛，本著“優(yōu)質(zhì)、服務(wù)、信譽”的精神，堅持以優(yōu)良的技術(shù)、優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品、良好的信譽為國內(nèi)外廣大用戶提供優(yōu)質(zhì)生物產(chǎn)品和服務(wù)。
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本公司鄭重承諾：質(zhì)量保證、供貨及時、服務(wù)周到。