細胞培養(yǎng)技術(shù)在生物研究領(lǐng)域內(nèi)是必不可少的核心環(huán)節(jié).在培養(yǎng)過程中面臨的一個嚴重問題就是細胞污染其中支原體是最主要的污染源。支原體在光學(xué)顯微鏡下不可見而且被支原體污染的細胞培養(yǎng)基在一般情況下往往并不渾濁,細胞受損程度也不明顯,形態(tài)很少改變,因此細胞被支原體污染后很難察覺。細胞一旦被支原體污染后.支原體會消耗細胞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì).代謝產(chǎn)物不斷積累.會導(dǎo)致細胞培養(yǎng)環(huán)境中pH值的改變誘導(dǎo)或抑制某些細胞因子的表達.會影響培養(yǎng)細胞的代謝和增殖特征。

在日常工作環(huán)境中支原體可以說無處不在.它可以通過人的毛發(fā)、口腔、穿著的衣服、動物的皮毛以及日常的細胞培養(yǎng)的操作環(huán)境造成對細胞的污染。能夠造成細胞污染的支原體種類有很多,有些細胞其至同時感染2種以上的支原體。由干支原體體積很小.直徑約在0.2-2.0pm之間.可以通過濾膜而直接造成培養(yǎng)基或血清的污染。從形態(tài)結(jié)構(gòu)上支原體形態(tài)多變.多吸附在細胞表面或分散于細胞與細胞之間,是一類沒有細胞壁的微生物.因此對作用于細胞壁類的抗生素(如青霉素)不敏感常用的檢測方法有培養(yǎng)法、熒光染色法、PCR法和電鏡觀察法。培養(yǎng)法是最為可靠目成本低廉的方法.但培養(yǎng)周期較長.常用于細胞以及臨床治療細胞的支原體檢查熒光染色法是用特異熒光染料(Hoechst 33258)染色后在熒光顯微鏡下進行檢測,熒光染料(Hoechst33258)是一種能和DNA特異結(jié)合物質(zhì).如果檢測樣品為支原體污染 則附在細胞表面和分散在細胞與細胞之間的支原體DNA著色 在熒光顯微鏡下可見PCR法檢測是通過對支原體特定的序列設(shè)計引物 當(dāng)存在支原體污染時通過PCR特異性擴增.會將目標(biāo) DNA特異性的復(fù)制,然后通過瓊脂糖電泳觀檢測.會跑出條帶出現(xiàn)陽性結(jié)果,反之當(dāng)沒有支原體污染時,由于沒有模板.PCR無法擴增.則瓊脂糖電泳跑不出條帶.出現(xiàn)陰性結(jié)果:電鏡觀察法是利用電子顯微鏡的超級放大功能直接觀察培養(yǎng)細胞中支原體污染情況。

在此主要介紹利用熒光染色法來檢測培養(yǎng)細胞中的支原體,具體檢測步驟如下:

(1)細胞爬片培養(yǎng):待測細胞培養(yǎng)至傳代水平.將細胞消化后接種至含有玻片的細胞板中,培養(yǎng)至60%-70%匯合時.進行檢測

(2)漂洗·將細胞板中的培養(yǎng)液吸出 取出玻片用PBS輕輕漂洗

(3)固定:加入適量的固定液.室溫放置10min

(4)漂洗:用PBS輕輕漂洗3次

(5)染色:加入適量的熒光染料(Hoechst 33258)工作液,在室溫下放置10min

(6)漂洗:用PBS輕輕漂洗3次:

(7)鏡下觀察:將玻片晾干后.滴加抗熒光猝滅劑,于熒光顯微鏡下觀察、拍照

(8)實驗結(jié)果如圖所示: