正常細胞中的磷脂酰絲氨酸(PhosphatidylserinePS)位于細胞膜的內(nèi)側(cè)在細胞發(fā)生凋亡時PS會從細胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜表面即暴露在細胞的外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量在35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白與PS有極高高親和力可以與之發(fā)生特異性結(jié)合將Annexin-V進行熒光素(FITC)標(biāo)記成Annexin-V. FITC探針用該探針標(biāo)記待檢測細胞利用流式儀通過檢測FITC信號即可反應(yīng)帶警車細胞的凋亡情況。

當(dāng)然對于現(xiàn)有的凋亡檢測試劑并沒有滿足于整體調(diào)亡情況的反映一般的試劑會結(jié)合碘化丙啶(propidineiodide.PI)進行更細層面的檢測。PI是一種核酸染料它不能透過完整的細胞膜但在調(diào)亡中晚期的細胞和壞死細胞細胞膜一般會發(fā)生破裂此時PI能夠細胞膜進入到細胞核內(nèi)嵌入到DNA中使細胞核釋放紅色熒光。

在操作過程中不論是分離組織細胞或是收集培養(yǎng)中的細胞需盡量避免污染一般收集1*106的細胞制備成1mL的細胞懸液按照凋亡檢測試劑盒說明書進行操作即可但一定要注意整個過程需要輕柔操作以免造成細胞是寫損傷而影響檢測結(jié)果。探針孵育完成后需在1小時以內(nèi)完成檢測另外上機檢測時記得配上不做任何標(biāo)記的陰性對照管哦。

對于實驗結(jié)果首先我們需要在細胞自身光散射特性方面進行評判。調(diào)亡細胞形態(tài)上的改變影響它們的光散射特性。在流式細胞儀上前向散射光與細胞的大小有關(guān)而側(cè)向散射光反映的是光在細胞內(nèi)的折射作用與細胞內(nèi)的顆粒多少有關(guān)。在細胞凋亡時細胞固縮體積變小故前向散射光降低這一特性往往被認(rèn)為是凋亡細胞的特點之一。此外細胞調(diào)亡時由于染色體降解核破裂形成細胞內(nèi)顆粒往往增多故凋亡細胞側(cè)向散射光常增加。細胞壞死時由于細胞腫脹其前向散射光增大側(cè)向散射光在細胞壞死時也增大因此可根據(jù)前向散射光和側(cè)向散射光區(qū)別調(diào)廣細胞和壞死細胞。但需要注意的是根據(jù)前散射光和側(cè)向散射光判斷凋廣細胞的可靠性受被檢測細胞形態(tài)上的均一性和核胞漿比率影響很大。因此我們必須要進行調(diào)亡因子的直接反映。

前面我們提到凋亡中晚期的細胞和壞死細胞由于其細胞膜損傷Pl能夠穿透細胞膜而嵌入DNA中是細胞核產(chǎn)生紅色熒光。而細胞膜保持完好的早期凋亡細胞對于細胞活性鑒定的染料PI有抗染性則不會有紅色熒光產(chǎn)生正常活細胞與之相似。在雙變顯流式細胞儀的散點圖上所呈現(xiàn)的結(jié)果即為左上象限顯示機械損傷細胞為(FITC-/PI+)左下象限顯示活細胞為(FITC-/PI-)右上象限是非活細胞即壞死細胞或晚期凋亡細胞為(FITC+/PI+)而右下象限為早期調(diào)亡細胞呈現(xiàn)(FITC+/PI-)。

最后提醒一下想要做流式凋亡檢測結(jié)果統(tǒng)計的科研汪們由于用流式檢測凋亡時PI受時間的影響很大,因為標(biāo)記了PI后會加大細胞毒性隨著時間延長會導(dǎo)致PI的染色增加特別是檢測早期凋亡時,如果時間延長除了會導(dǎo)致在流式細胞儀上的細胞分群差距加大外誤差會明顯加大。根據(jù)以前做流式凋亡時的經(jīng)驗建議每組實驗一次可以先做三個復(fù)孔上機前5分鐘加Pl在半小時內(nèi)檢測完畢。這時可以先分析下三個復(fù)孔的差異。等待摸索的實驗條件成熟后每組實驗一次可以做6~8個復(fù)孔然后做統(tǒng)計學(xué)分析。嚴(yán)格說來當(dāng)做出統(tǒng)計學(xué)差異時這樣的實驗還要重復(fù)三次。但是因檢測凋亡時，受細胞狀態(tài)PI染色時間，流式檢測時間,以及每次實驗時的誤差等的影響外很難保證能夠完全重復(fù)出上次的結(jié)果甚至即使在保證了實驗條件幾乎相同的情況下每次重復(fù)的差異也會中現(xiàn)加大的情況。這時可以話當(dāng)重復(fù)2~3次盡量使差異減小。