高純質(zhì)粒大提試劑盒
一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介。
本產(chǎn)品是一款從工程菌內(nèi)大量提取質(zhì)粒 DNA 的試劑盒，并能夠去除蛋白質(zhì)與 RNA，得到高純度的質(zhì)粒 DNA，用于轉(zhuǎn)染和酶切等生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
二、運(yùn)輸與存儲(chǔ)條件。
本試劑盒中的 RNase A 需低溫運(yùn)輸，-20 ℃保存，其它組份常溫運(yùn)輸與保存，有效期 12 個(gè)月。
三、特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì)。
1. 有效去除蛋白質(zhì)與 RNA，得到高純度的質(zhì)粒 DNA。
2. DNA 純化柱可結(jié)合 5 mg 質(zhì)粒 DNA。
四、使用說明。
1. 試劑配制：
a) Buffer P1 (重懸液) 配制。將 RNase A 全部加入 Buffer P1 中，混勻，4 ℃保存。
b) Buffer W3（漂洗液）配制。溶液中加入 70 mL 無水乙醇，混勻。
2. 細(xì)菌收集。將菌液加入 50 mL 離心管，12,000×g 離心 2 min，棄上清。剩余菌液加入對(duì)應(yīng)的離心管中，再次離心并棄上清，直至所有菌液收集完畢，將離心管倒立在紙巾上，吸盡殘余液體。
3. 加入 7.5 mL Buffer P1（確定加入 RNase A），振蕩（vortex）至細(xì)菌完全重懸。（若細(xì)菌沉淀沒有完全重懸，會(huì)影響裂解效果，降低質(zhì)粒 DNA 提取量。）
4. 加入 7.5 mL Buffer P2（室溫較低時(shí)，Buffer P2 易沉淀，請(qǐng)?jiān)?37 ℃水浴鍋中加熱 10 min，待沉淀消失后再使用），輕柔地上下翻轉(zhuǎn) 20 次，液體變透明，保證細(xì)菌充分裂解。
（不要?jiǎng)×艺鹗帲╲ortex），以免 DNA 斷裂。裂解時(shí)間不宜超過 5 min，以免質(zhì)粒 DNA 受到破壞。細(xì)菌充分裂解后液體變得清亮粘稠。如果仍然渾濁，則細(xì)菌過量，裂解不徹底，應(yīng)加大裂解液用量。）
5. 加入 10.5 mL Buffer P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 20 次，充分混勻，出現(xiàn)白色絮狀沉淀。（混勻要充分，以免出現(xiàn)局部沉淀，影響中和效果。）
6. 12,000×g 離心 10-20 分鐘，上清轉(zhuǎn)入新的 50 mL 離心管中。（盡量避免吸取白色沉淀）
7. 上清加入 DNA 純化柱，12,000×g 離心 1 min，棄濾液。剩余的上清液依次加入相應(yīng)的 DNA 純化柱，12,000×g 離心 1 min，棄濾液，完成 DNA 吸附。
8. 加入 5 mL Buffer W1（去蛋白液），12,000×g 離心 2 min，棄濾液。
9. 加入 5 mL Buffer W3（漂洗液），12,000×g 離心 2 min，棄濾液。
10. 空的 DNA 純化柱，12,000×g 離心 3 min，盡量去除 DNA 純化柱中殘余液體。
11. 將 DNA 純化柱轉(zhuǎn)移至新的 50 mL 離心管（質(zhì)量好的離心管，確保不會(huì)因?yàn)殡x心過大而破碎，從而導(dǎo)致質(zhì)粒提取失敗），在柱中央滴加 2 mL Elusion Buffer D 或 ddH2O，室溫靜置 5 min。
12. 12,000×g 離心 2 min，收集質(zhì)粒 DNA 溶液。
13. 在純化柱中央再次滴加 2 mL Elusion Buffer D 或 ddH2O，室溫靜置 5 min， 12,000×g 離心 2 min，收集質(zhì)粒 DNA 溶液。（本試劑盒中的 DNA 純化柱為高結(jié)合力的核酸純化柱，需要洗脫兩次以上才能將吸附的質(zhì)粒完全洗脫下來）
14. 測(cè)定質(zhì)粒 DNA 濃度，或置于-20 ℃冰箱中保存。
五、注意事項(xiàng)
1. 質(zhì)粒提取量與細(xì)菌濃度及質(zhì)?？截悢?shù)等因素有關(guān)，低拷貝質(zhì)?；虼笥?0 kb的大質(zhì)粒提取時(shí)應(yīng)加大細(xì)菌使用量。
2. 使用70 ℃預(yù)熱的Elution Buffer D或ddH2O洗脫質(zhì)粒DNA，可以提高洗脫效率。
3. 利用新轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)菌可以提高質(zhì)粒DNA產(chǎn)量。
4. 洗脫體積不應(yīng)小于2 mL，否則降低DNA產(chǎn)量。
5. 為了您的健康，實(shí)驗(yàn)過程中請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服，并佩戴手套與口罩。
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