熒光標記抗體的蛋白質印跡法

        對于蛋白質印跡，將膜與稀釋在含有5% w/v BSA或脫脂奶粉的1×TBST（0.1% Tween®20）中的一抗在振蕩器上于4°C下孵育過夜。請參閱一抗產品網頁了解推薦的一抗稀釋緩沖液和抗體稀釋度。

        雙色蛋白質印跡需要來自不同物種的一抗和用不同染料標記的二抗。表位重疊可能會造成干擾，在雙色蛋白質印跡中應予以考慮。如果一抗需要不同的一抗孵育緩沖液，則在兩種緩沖液中測試每種一抗，以確定最適合雙標記實驗的緩沖液。

所需溶液和試劑

        - 20×磷酸鹽緩沖液（PBS）1 L：將50 ml 20×PBS 加入 950 ml dH2O 中并混合。

        - 10×Tris緩沖鹽水（TBS）1 L：將100 ml 10×TBS 加入900 ml dH2O 中并混合。

        - 1×SDS上樣緩沖液：藍色上樣包或紅色上樣包；將1/10體積的30×二硫蘇糖醇（DTT）加入1 體積的3×SDS上樣緩沖液中，配制新鮮的3×還原性上樣緩沖液。用dH2O稀釋至1×。

        - 10×Tris-Glycine SDS電泳緩沖液1 L：將100 ml 10×電泳緩沖液加入900 ml dH2O中并混合。

        - 10×Tris-Glycine轉移緩沖液1 L：將100 ml 10×轉移緩沖液添加到200 ml甲醇+ 700 ml dH2O中并混合。

        -10×Tris緩沖鹽水（含Tween®20）（TBST-10×）1 L：將100 ml 10×TBST 加入900 ml dH2O 中并混合。

        - 脫脂奶粉。

        - 封閉緩沖液：1×TBS加5% w/v 脫脂奶粉；若要制備150 ml，則將7.5 g脫脂奶粉加入150 ml 1×TBS 中并充分混合。不應將Tween® 20 添加到封閉緩沖液中，因為它具有自發(fā)熒光，并且會增加非特異性背景。封閉步驟后，將Tween®20添加到后續(xù)稀釋緩沖液中。

        - 洗滌緩沖液：1×TBST。

        - 牛血清白蛋白（BSA），如B265993。

        - 一抗稀釋緩沖液：1×TBST，含 5% BSA或5%脫脂奶粉，如一抗數據表所示；若要配制20 ml，則將1.0 g BSA或脫脂奶粉加入20 ml 1×TBST 中并混勻。

        - 二抗稀釋緩沖液：1×TBST加5%脫脂奶粉；將1.0 g脫脂奶粉加入20 ml 1×TBST中并充分混合。（二抗；抗兔Ab181958 和 Ab176447；抗鼠 Ab181952 和 Ab179006）。

        - 預染蛋白質標準，范圍廣（10 - 180 kDa），例如M665706。

        - 對于印跡膜和紙，通常建議孔徑為0.2 µm。

        注意：建議使用反滲透去離子（RODI）水或同等級別的水來配制溶液。

實驗步驟

1. 樣品制備

1）從培養(yǎng)物中吸出培養(yǎng)基并用預冷的1×PBS清洗細胞。

2）除去 PBS，加入 1×SDS 樣品緩沖液（6 孔板每孔 100 µl或10 cm 直徑板每板 500 µl）以裂解細胞。立即從板上刮下細胞，將提取物轉移到微量離心管中，放在冰上。

3）超聲波處理10 - 15秒。

4）取每個樣品20 µl，在95 - 100 ℃下加熱5分鐘，然后在冰上冷卻。

        注意：具體上樣量可根據蛋白濃度及實驗要求進行調整，為避免蒸發(fā)、粘壁等造成體積損失，需制備適量樣品。

5）放入微量離心機離心5分鐘。

2. 上樣及電泳

1）組裝預先配置好的SDS-PAGE凝膠（10 cm×10 cm），并加入電泳緩沖液。

2）將20 µl上樣到SDS-PAGE凝膠（10 cm×10 cm）上。

        注意：具體上樣量可根據蛋白濃度和實驗要求進行調整。

        建議加入預染蛋白分子量標準品（M665706，10 µl/lane）來驗證蛋白轉移并測定分子量。

3）根據蛋白質的分子量設置電壓和電泳時間，開始跑膠。

3. 轉膜

        按正確的順序組裝凝膠和轉印裝置，設定電壓和轉印時間，轉移到硝酸纖維素膜上。有關詳細的轉移程序，請參閱《蛋白質印跡的通用實驗方案》。

4. 膜阻斷和抗體孵育

        注：容量適用于10 cm×10 cm（100 cm2）的膜；對于不同尺寸的膜，容量相應調整。

1）（可選）轉移后，室溫下用25 ml TBS清洗硝酸纖維素膜5分鐘。

2）將膜放入25 ml封閉緩沖液中，室溫下孵育1小時。

        注意：請勿將 Tween®20添加到封閉緩沖液中。

3）用15 ml TBST洗滌三次，每次5分鐘。

4）取10 ml封閉緩沖液加入一抗（按產品說明書建議稀釋度），配制一抗稀釋液，將膜放入一抗稀釋緩沖液中，在振蕩器上4°C孵育過夜。

5）用15 ml TBST洗滌三次，每次5分鐘。

6）將膜放入 10 ml熒光素偶聯(lián)的二抗稀釋液（如Ab181958、 Ab176447、 Ab181952 和 Ab179006）（1 mg/ml 原液，稀釋度為 1:5000-1:25,000）中，并在振蕩器上室溫孵育1小時。

7）用15 ml TBST洗滌三次，每次5分鐘。

5. 蛋白質檢測

1）瀝干膜上多余的TBST，并使其干燥。

        注意：對于熒光染色，確保膜干燥非常重要。

2）使用合適的熒光掃描儀并按照制造商的建議掃描膜。

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