細胞培養(yǎng)通用指南
實驗室培養(yǎng)的細胞，按照細胞類型劃分，大致可分為以下三類。
（1）貼壁細胞：細胞粘附于培養(yǎng)容器（例如組織培養(yǎng)塑料）。
（2）懸浮細胞：所有細胞都隨生長培養(yǎng)基懸浮生長，并不附著在培養(yǎng)容器上生長。
（ 3）半貼壁細胞：一些細胞松散地粘附在培養(yǎng)容器上，另一些細胞可能懸浮在生長培養(yǎng)基中。
細胞也可以根據(jù)其生長特性進行分類，分為有限增殖和無限增殖：
有限增殖：僅增殖并維持有限數(shù)量的群體倍增活力。常見的例子是直接從組織中分離的原代細胞，或在一定次數(shù)的傳代后停止生長（衰老）的細胞系。
無限增殖：具有無限分裂能力的細胞（永生化）。通常通過轉(zhuǎn)化產(chǎn)生，以獲得類似癌癥的表型（例如失去接觸抑制、無限生長）。
本文我們將重點介紹最常見的細胞類型：貼壁細胞和懸浮細胞。請注意：所有涉及培養(yǎng)細胞操作的程序都應(yīng)使用無菌技術(shù)和適當(dāng)?shù)目刂品椒ㄟM行。
第 1 階段 冷凍保存
遺傳不穩(wěn)定性在持續(xù)培養(yǎng)的細胞中不斷積累。因此，應(yīng)在收到細胞系后盡快將其冷凍并儲存。這可確保細胞庫存在遺傳上盡可能接近源材料，并降低污染風(fēng)險。冷凍過程應(yīng)在有冷凍保護劑（如DMSO）的情況下以可控方式（理想情況下以每分鐘1°C的速度）冷凍細胞，以防止細胞內(nèi)形成冰晶并導(dǎo)致培養(yǎng)物活力喪失。
實驗步驟
1.使用顯微鏡觀察細胞，檢查其整體外觀，確保沒有微生物污染的跡象。同時，確保細胞處于對數(shù)增長階段，細胞密度不應(yīng)超過細胞系的指導(dǎo)范圍，活力一般應(yīng)大于90%。
2.按照標準傳代培養(yǎng)方法收集并計數(shù)細胞。懸浮細胞以每毫升2 - 5×106個細胞的密度凍存，貼壁細胞以每毫升1 - 2×106個細胞的密度凍存。
3.根據(jù)細胞系特點，選擇合適的冷凍保護劑，同時根據(jù)細胞數(shù)量計算所需的冷凍液，按照配方配置冷凍液。
注意，如果冷凍液中添加DMSO，因DMSO添加時會釋放熱量，盡量提前配置。
4.以200 × g離心細胞懸浮液5分鐘，去除上清液，并將細胞沉淀物重新懸浮在PBS中。
5.以200 × g離心5分鐘，去除上清。
6.用配置好的冷凍液重懸細胞沉淀，充分混勻后，轉(zhuǎn)移到適當(dāng)數(shù)量的凍存管中，并標記日期、名稱、細胞編號、傳代數(shù)和細胞類型等重要信息。
7.將凍存放入凍存盒中，在-80°C下放置一夜。這樣可以控制溫度下降。
8.轉(zhuǎn)移到液氮罐中長期儲存。
第二階段 細胞復(fù)蘇
需要使用時，應(yīng)盡快解凍細胞，以盡量減少對細胞活力的不利影響。建議在復(fù)蘇時通過離心將冷凍保存劑從培養(yǎng)基中去除。
實驗步驟
1.從液氮儲存中取出冷凍管并放入37°C水浴中，輕輕晃動管子，加速解凍，仔細監(jiān)測小瓶，當(dāng)管內(nèi)解凍至黃豆大小時可將凍存管從水浴鍋中取出。
2.將凍存管內(nèi)細胞（1 ml）轉(zhuǎn)移至裝有預(yù)熱培養(yǎng)基（4 ml）的15 ml離心管中，200 - 250 × g，離心5分鐘。
注，離心速度和時間僅供參考，可根據(jù)具體實驗要求調(diào)整。
3.除去上清液并重新用適量預(yù)熱培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，選擇合適的接種密度，把細胞接種至相應(yīng)的培養(yǎng)容器中進行培養(yǎng)。
4.根據(jù)細胞類型需要，添加對應(yīng)所需的生長因子等成分。
第 3 階段 觀察
應(yīng)定期用顯微鏡和肉眼觀察細胞是否有微生物污染跡象。還應(yīng)使用顯微鏡檢查來確定細胞的總體健康狀況并確定是否需要進行傳代培養(yǎng)。
實驗步驟
1.用肉眼觀察細胞培養(yǎng)的狀態(tài)，排除污染。
對于貼壁細胞，生長培養(yǎng)基應(yīng)該是清澈的。如果不是，這可能是污染的跡象，或者細胞已經(jīng)超過匯合度并且正在死亡或從培養(yǎng)表面脫落。
對于懸浮細胞，由于溶液中懸浮著細胞，培養(yǎng)基會更渾濁。如果渾濁度比預(yù)期的要高，再加上酸性培養(yǎng)基，可能表示存在污染或細胞密度高，需要進行傳代培養(yǎng)。
溫度水平、二氧化碳和成分的代謝都會影響生長培養(yǎng)基的pH值。
2.通過以下幾個方面，在光學(xué)顯微鏡下觀察細胞的生長或是否污染等情況。
細胞貼壁。確保細胞粘附于培養(yǎng)容器，或如預(yù)期那樣處于懸浮狀態(tài)。
細胞形態(tài)。檢查培養(yǎng)物以確認細胞形態(tài)符合預(yù)期。形態(tài)不同可能是污染或分化的征兆。
融合度（針對貼壁細胞）。這是細胞覆蓋細胞培養(yǎng)表面的百分比。100%表示細胞完全覆蓋培養(yǎng)容器表面。細胞需要進行亞培養(yǎng)的百分比取決于細胞系，但最常見的是70%。
細胞密度。通過進行細胞計數(shù)來監(jiān)測懸浮細胞的健康和生長特性。收集細胞樣本并使用血球儀或自動細胞計數(shù)器進行細胞計數(shù)。細胞系需要進行傳代培養(yǎng)的密度取決于細胞系。
注意定期對細胞進行檢測，排除支原體污染，同時在培養(yǎng)過程中，持續(xù)監(jiān)測細胞是否有細菌、真菌和酵母污染的跡象。不同的細胞系也可能污染培養(yǎng)物。
第四階段 細胞維持和傳代培養(yǎng)
如果細胞生長健康且達到了所需的匯合度，則可以進行傳代培養(yǎng)和/或接種細胞以供實驗使用。
如果細胞尚未達到所需的匯合度，并且自上次傳代培養(yǎng)以來已過去2-3天，則更換培養(yǎng)基并繼續(xù)，直到達到所需的匯合度。
如果細胞出現(xiàn)污染跡象，則應(yīng)將其丟棄。
● 更換培養(yǎng)基
培養(yǎng)細胞時需要定期更換培養(yǎng)基，以防止有毒代謝物（例如乳酸）的積累，并確保生長培養(yǎng)基成分的持續(xù)供應(yīng)。細胞代謝物的積累通常通過pH指示（例如酚紅）進行監(jiān)測，并以此確定完成細胞培養(yǎng)基更換的合適時間。
實驗步驟
1.吸取生長培養(yǎng)基。
對于懸浮細胞，先將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至離心管，以200-250 × g的速度離心5分鐘，去移除培養(yǎng)基。
對于貼壁細胞，將培養(yǎng)容器略微傾斜，直接吸出培養(yǎng)基，注意不用完全吸干凈。
2.重新添加新鮮的生長培養(yǎng)基。
對于懸浮細胞，用適量新鮮生長培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，混勻后轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)容器中。
對于貼壁細胞，直接沿壁加入適量的新鮮生長培養(yǎng)基。
3.將培養(yǎng)容器及時放入培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，繼續(xù)監(jiān)測細胞的生長情況和污染跡象。
● 傳代培養(yǎng)
如果細胞生長到所需的匯合度或密度，則應(yīng)進行繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)也稱為傳代，是將細胞從之前的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)容器中，加入新鮮培養(yǎng)基，以繼續(xù)生長。
實驗步驟
1.清洗并收集細胞。
對于懸浮細胞，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至離心管，以 200-250 × g的速度離心5分鐘。除去培養(yǎng)基并將細胞沉淀物懸浮在適當(dāng)體積的PBS中，清洗一遍，離心去除PBS。
將細胞沉淀重懸于新鮮生長培養(yǎng)基中。
對于貼壁細胞：
（1）將培養(yǎng)容器略微傾斜，直接吸出培養(yǎng)基，添加適當(dāng)體積的PBS清洗，確保細胞培養(yǎng)物被覆蓋，吸出并丟棄PBS。
（2）添加適當(dāng)?shù)南?，?a >胰蛋白酶，并在37°C下孵育，直至細胞分離。
（3）添加新鮮培養(yǎng)基并將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到離心管中。
（4）以200-250 × g的速度離心5分鐘。
（5）除去培養(yǎng)基并將用適當(dāng)體積的PBS重懸細胞沉淀，混勻充分清洗。
（6）以200-250 × g的速度離心5分鐘。
（7）吸出并丟棄PBS，將細胞沉淀重懸于新鮮生長培養(yǎng)基中。
注意：培養(yǎng)容器所需的任何包被涂層都應(yīng)在細胞分離之前進行。
2.選擇適合傳代稀釋比例，將適量的細胞接種到新的培養(yǎng)容器中，添加生長培養(yǎng)基至所需體積。
3.在培養(yǎng)容器上標注關(guān)鍵信息，包括細胞類型、傳代次數(shù)、接種密度/分裂比、日期和操作人等。并按要求進行孵育。
4.繼續(xù)每天監(jiān)測細胞的生長情況和污染跡象。
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