超分辨成像技術(shù)打破了光學顯微鏡的Abbe’s衍射極限，提供了卓越的空間和時間分辨率。在各種超分辨率成像技術(shù)中，受激發(fā)射損耗納米顯微鏡（STED）非常適合于活細胞成像，是研究活細胞動態(tài)的重要工具。在STED成像中，損耗激光的功率高達數(shù)GW/cm2。因此，在活細胞中進行長時間STED成像需要熒光物質(zhì)同時具備以下特性：1）優(yōu)異的光穩(wěn)定性以抵抗光漂白；2）極小的光毒性以維持活細胞處于正常生理狀態(tài)；3）長的波長（>650 nm）以減小光損傷并減少自發(fā)熒光干擾；4）高的亮度以提高圖像的信號/噪聲比；5）大的Stokes位移以避免熒光物質(zhì)的自吸收。然而，現(xiàn)有熒光染料很少能同時具備這些性質(zhì)。近日，中南大學宋相志團隊、新加坡科技設(shè)計大學劉曉剛團隊以及安徽大學張瑞龍團隊聯(lián)合報道了一種改良染料多方位性能的通用性策略，以適用于活細胞內(nèi)長時間超分辨成像。
圖1. DMA染料結(jié)構(gòu)。
在這項研究中，作者通過引入9,9-二甲基-9,10-二氫吖啶（DMA）作為電子供體，很好彌補了傳統(tǒng)染料在光穩(wěn)定性、光毒性、波長、亮度和Stokes位移多方面的缺點。DMA供體通過擴大染料的π共軛體系來實現(xiàn)波長紅移；其相對剛性的結(jié)構(gòu)有利于染料保持高量子產(chǎn)率；而特定的蝶形震動增加了分子的幾何弛豫進而增大了Stokes位移；更重要的是，DMA供體有效抑制了染料分子形成三重態(tài)，并具有強的抗氧化能力，因而DMA基染料能對抗光降解，并降低對活細胞的光毒性。有意義的是，DMA適用于各類熒光染料家族，不僅包括羅丹明家族染料，還包括二氟硼絡(luò)合物和香豆素衍生物等。通過DMA優(yōu)化的羅丹明和香豆素染料對線粒體和脂滴進行雙色標記，并在超分辨鏡頭下研究了它們長時間動態(tài)相互作用；通過對HaloTag標記的膜蛋白的STED成像，進一步證實了DMA染料優(yōu)越的光穩(wěn)定性以及在蛋白質(zhì)長時間可視化成像中的重要應(yīng)用。
圖2. DMA染料對HaloTag蛋白的實時STED成像。
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