鎳柱
親和層析技術的基本原理在于，它依賴于分子間獨特的、高度特異性的相互作用，這些相互作用使得分子間能夠形成既專一又可逆的結合，這種力量我們稱之為親和力。
在生物科學中，存在多種具有專一性親和力的生物分子對，例如：
酶與基質類似物、抑制劑或輔酶之間；
抗體與抗原、病毒或細胞之間；
細胞與其表面的特異蛋白、外源凝集素之間；
核酸與互補堿基序列、組蛋白或核酸聚合酶之間；
激素或藥物與受體、載體蛋白之間；
外源凝集素與多糖、糖蛋白、細胞表面受體或細胞之間。
在親和層析過程中，那些能夠與待分離物質特異性結合的分子被固定在色譜基質上，這些被固定的分子被稱為配體。配體與基質之間通過共價鍵緊密相連，共同構成了親和層析的固定相，也被稱為親和吸附劑。為了構建這種親和吸附劑，配體首先需要通過共價鍵與經過活化的基質相結合，從而形成固相載體。常用的載體材料包括瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠以及纖維素等，它們?yōu)橛H和層析提供了穩(wěn)定且高效的分離平臺。
咪唑環(huán)，作為一種五元雜環(huán)化合物，其結構特點是含有一個1,3-二氮雜環(huán)，英文表述為Imidazole。若從咪唑環(huán)上位于第一位或第三位的氮原子上移除與之直接相連的氫原子，所得的部分則被稱作咪唑基團。簡而言之，咪唑基團是咪唑分子中去除一個與氮原子直接相連的氫原子后剩余的結構片段。
組氨酸的特性在于其輕微的疏水性以及咪唑環(huán)所賦予的微弱電性。
多種過渡金屬離子，如Cu²?、Ni²?、Zn²?、Co²?等，能與N、S、O等供電子原子形成配位鍵，進而與蛋白質表面的特定基團如組氨酸（His）的咪唑基、半胱氨酸（Cys）的巰基以及色氨酸（Trp）的吲哚基發(fā)生強烈的親和性結合，其中咪唑基與金屬離子的結合尤為牢固。這些金屬離子與咪唑基的結合力按照Cu²?、Ni²?、Zn²?、Co²?的順序遞減。
鎳離子具有六個潛在的螯合位點。在鎳柱的應用中，根據螯合位點的不同，鎳柱被分為Ni-NTA和Ni-IDA兩種類型。Ni-NTA螯合了四個位點，留下兩個空位；而Ni-IDA則螯合了三個位點，剩余三個空位。因此，Ni-IDA Agarose的結合能力相對更強，能夠在相同條件下承載更多的蛋白質，但需要使用更高濃度的咪唑來洗脫雜質和目標蛋白。然而，Ni-NTA在穩(wěn)定性方面表現出優(yōu)勢，更能耐受強還原劑的作用，鎳離子不易脫落。因此，在選擇鎳柱時，需要根據具體的純化條件進行權衡，以達到最佳的純化效果。
基質特性概述：
基質是一種具有多孔網狀結構的不溶性材料，其滲透性能優(yōu)異。它具備高度的物理和化學穩(wěn)定性，能夠承受較大的機械應力，從而確保較長的使用壽命。此外，基質還能有效抵抗微生物和酶的侵蝕，保持其結構的完整性。理想的基質應具有均勻的球形粒子，以提高分離效率。同時，基質應具有親水性，避免非特異性吸附，且含有可活化的反應基團，便于親和配體的固定。
瓊脂糖凝膠微球實例：
瓊脂糖凝膠微球，商品名為Sepharose，根據其含糖濃度的不同，分為2B、4B和6B三種類型。其中，Sepharose 4B的結構相對疏松，吸附容量適中，因此在實際應用中最為廣泛。
配基的選擇原則：
配基是一種能夠可逆結合特定分子或基團的分子，是親和色譜純化的關鍵。選擇配基時，需考慮其特異性和可逆性，確保與目標物能夠穩(wěn)定結合并易于分離。同時，配基應具有化學修飾基團，便于吸附在基質上，且不影響其活性。
間隔臂的作用與選擇：
當目標蛋白質的結合位點位于分子內部時，直接偶聯配基可能受到空間位阻的影響，導致結合能力降低。此時，可在配基與基質之間插入一個間隔臂，以提高結合效率。間隔臂的長度需適中，過短可能無效，過長則可能導致非特異性結合。一般來說，當偶聯的分子量較小時，需要使用間隔臂；而當分子量較大時，則不一定需要。
二硫鍵在蛋白質結構中的作用：
二硫鍵是蛋白質中半胱氨酸殘基之間形成的共價鍵，對蛋白質的立體結構起著重要作用。為了確定蛋白質的一級結構，需要打開二硫鍵，使其變?yōu)榫€狀多肽鏈。
親和層析的上樣與洗脫方式：
上樣方式包括直接上樣和間接上樣兩種。洗脫方式則根據配基和目標物的性質而定，包括pH值洗脫、離子強度洗脫和競爭性洗脫（如使用咪唑）。
親和層析柱的再生步驟：
為了恢復親和層析柱的性能，需要進行再生處理。具體步驟包括：首先用強變性劑（如6M鹽酸胍）沖洗柱子以去除殘留的蛋白質；然后用水沖洗干凈；接著用0.2%SDS沖洗柱子以去除殘留的變性劑；再次用水沖洗干凈；之后用50%乙醇沖洗柱子以去除SDS；再次用水沖洗干凈；然后用含有Tris和EDTA的緩沖液（如100mM EDTA, 50mM Tris, pH 8.0）沖洗柱子以去除金屬離子；再次用水沖洗干凈；最后用100mM硫酸鎳孵育柱子以重新固定鎳離子；最后以20%乙醇保存柱子于4℃環(huán)境中備用。
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