連接酶（Ligase），或稱連結(jié)酶和結(jié)合酶。是一種催化兩種大型分子, 以一種新的化學(xué)鍵結(jié)合一起的酶，一般會涉及水解其中一個分子的團(tuán)，又稱合成酶。能催化兩個分子連接成一個分子或把一個分子的首尾相連接的酶。此反應(yīng)與ATP的分解反應(yīng)相偶聯(lián)，在把兩分子相連接的同時，發(fā)生三磷酸腺苷（ATP)的高能磷酸鍵的斷裂，如DNA連接酶等。連接酶是酶分類中重要的一類 (EC 6): 6.1形成C-O鍵；6.2形成C-S鍵；6.3形成C-N鍵；6.4 形成C-C鍵。連接酶通常是包括“連接酶”這個字，就如DNA連接酶是將脫氧核糖核酸（DNA）片段連接。其他普遍的名稱包括“合成酶”，因?yàn)檫@些酶是用作合成新的分子，或當(dāng)它們是將二氧化碳加入一個分子時則稱為“羧化酶”。DNA連接酶有兩類，一類以NAD為輔基，主要來源于細(xì)菌，代表是E. coli連接酶，常規(guī)反應(yīng)條件下能連接切口（Nick）、粘性（Cohensive）末端雙鏈 DNA。 另一類以 ATP 為輔基，來源于病毒、噬菌體、真核生物DNA，代表是T4Lig，能連接切口、粘性末端雙鏈DNA，常規(guī)反應(yīng)條件下能夠連接平端（Blunt）DNA。在 各 種 形 式 的 蛋 白 質(zhì) 翻 譯 后 修 飾Post-translational Modifications，PTM) 過程中，泛素化過程近年來引起了越來越廣泛的關(guān)注，與蛋白質(zhì)磷酸化信號傳導(dǎo)作用相似，泛素化在細(xì)胞生命活動的許多進(jìn)程中，發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。2004年諾貝爾化學(xué)獎授予了在“泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解過程研究”中，做出開創(chuàng)性貢獻(xiàn)的三位科學(xué)家。泛素是一個由76個氨基酸殘基，組成的高度保守的多肽，因其廣泛分布于各類細(xì)胞中而得名，被泛素標(biāo)記的蛋白質(zhì)將被特異性地識別并被迅速降解。
泛素酶復(fù)合體三維結(jié)構(gòu)圖

目前 DNA 連接反應(yīng)機(jī)理是基于切口雙鏈 DNA 底物得到的：普遍認(rèn)為連接反應(yīng)由三步完成：①T4Lig先由ATP供能產(chǎn)生E-AMP復(fù)合物；②E-AMP復(fù)合物識別雙鏈DNA切口位置，將AMP轉(zhuǎn)移到5’-P基團(tuán)，形成 5’-P -AMP 復(fù)合物；③3’-OH 親核攻擊 5’-P-AMP 形成磷酸二酯鍵，并釋放出AMP。在 PDB 數(shù) 據(jù) 庫（October 2015Release）檢測不到 T4Lig 的晶體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致連接機(jī)理不完全明了，特別是平端 DNA 連接機(jī)理不完善。以熱穩(wěn)定性 Pfu DNA 連接酶晶體結(jié)構(gòu)為模板，筆者通過同源分子建模模擬 T4Lig 結(jié)構(gòu)。 顯示出DNA連接酶有三個保守性結(jié)構(gòu)域，DNA 結(jié) 合 結(jié) 構(gòu) 域 DBD（DNA- binding domain，M1~ L129），腺 苷 酰 化 結(jié) 構(gòu) 域 Ad D（Adenylaition domain，I130~E368），寡核苷酸鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域OBD（Oligonucleotide-binding-fold，V369~E482）. 腺苷?；Y(jié)構(gòu)域Ad D中 K159 是腺苷酰化位點(diǎn)，通過該位點(diǎn)形成 N6-AMP-lysine 酶-底物復(fù)合物。

T4 DNA連接酶原理圖

雖然 T4Lig 作為 DNA 連接的工具酶，使用了近 60 年，但是因?yàn)橛晒咎峁?、同時又是廣泛使用，科研人員對其性質(zhì)了解還不全面，特別是平端 DNA 連接機(jī)理。通過綜述 T4Lig 的酶分子大小、保真性、切口DNA 連接機(jī)理、連接端口檢測、酶分子性質(zhì)理性改造等方面的研究進(jìn)展，全面了解它的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、功能，以期達(dá)到快速高效體外 DNA 連接，同時總結(jié)了幾個有待解決的問題，以期對 T4Lig 有更深入、更全面的研究理論。隨著越來越多的新型泛素連接酶的發(fā)現(xiàn)，更多的三維結(jié)構(gòu)信息和功能研究成果的不斷積累，我們對這類具有重要功能的酶家族會有進(jìn)一步更深入的認(rèn)識。[1] 賀添艷,劉亞娟,徐文選,劉猛,劉亮偉. T4 DNA連接酶性質(zhì)及其平端連接功能[J]. 河南科學(xué),2016,(07):1058-1062. 
[2] 楊娜,侯巧明,南潔,蘇曉東. 泛素連接酶的結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2008,(01):14-20. 
[3] 楊東葉,劉凱于,余澤華. 泛素連接酶E3[J]. 細(xì)胞生物學(xué)雜志,2005,(03):281-285. 
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