背景及概述^[1]

光色素即二甲基異咯嗪，是人和哺乳動(dòng)物尿液中核黃素的代謝產(chǎn)物。由核黃素在酸性溶液中經(jīng)光解作用所產(chǎn)生的藍(lán)色熒光化合物。光色素是核黃素的光降解產(chǎn)物之一，在細(xì)胞氧化和能量代謝中起著重要的作用。此外，核黃素在體外對骨形成有積極作用并且促進(jìn)成骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)。據(jù)報(bào)道，光色素和核黃素可保護(hù)大鼠心臟免受缺血再灌注損傷。

結(jié)構(gòu)

應(yīng)用^[2]

光色素可減弱OVX小鼠骨丟失，并通過抑制RANKL誘導(dǎo)的NFAT、鈣信號、NF-κB和MAPK的激活，抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化和骨吸收，光色素還能促進(jìn)成骨細(xì)胞的早期分化。因此，光色素有潛力開發(fā)程治療骨質(zhì)疏松和其他骨溶解性疾病的藥物。研究表明，光色素可以通過抑制破骨細(xì)胞形成來防止卵巢切除引起的骨丟失。此外，光色素還通過抑制NFAT活化和鈣信號通路抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成和骨吸收。

1.光色素抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成與融合

觀察光色素對破骨細(xì)胞形成的影響，將BMMS與RANKL和M-CSF共同培養(yǎng)5天，加入不同濃度的光色素，觀察其對破骨細(xì)胞形成的影響。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)光色素濃度達(dá)到7.5μM時(shí)，其對TRACP陽性細(xì)胞的形成有抑制作用。為了確定光色素的作用是否是由于細(xì)胞毒性，進(jìn)行了MTS試驗(yàn)。結(jié)果表明，在10μM濃度和更低濃度條件下，光色素對小鼠無細(xì)胞毒作用。此外，為了評價(jià)光色素對破骨細(xì)胞融合的影響，發(fā)明人用羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色形成的破骨細(xì)胞來顯示F-actin，并用DAPI識別細(xì)胞核。結(jié)果表明，10μM濃度下的光色素對破骨細(xì)胞的形成和每個(gè)破骨細(xì)胞的平均核數(shù)均有明顯的抑制作用(圖2B，2C)。綜上所述，光色素對RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成和破骨細(xì)胞融合具有抑制作用，但對BMMS無細(xì)胞毒性作用。

2.光色素抑制破骨細(xì)胞的骨吸收

為探討光色素對破骨細(xì)胞骨吸收的抑制作用，發(fā)明人在羥基磷灰石板上種植了相同數(shù)量的成熟破骨細(xì)胞，觀察其對破骨細(xì)胞骨吸收的影響。將成熟的破骨細(xì)胞暴露于7.5μm或10μm光色素24h。TRACP染色顯示，光色素不影響成熟破骨細(xì)胞的數(shù)量。然而，與未干預(yù)組相比，用光色素干預(yù)組的吸收面積明顯減少。因此，這些數(shù)據(jù)表明，光色素抑制破骨細(xì)胞的骨吸收，但對成熟的破骨細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性作用。

3.光色素對RANKL誘導(dǎo)的基因表達(dá)有抑制作用

進(jìn)一步研究了光色素在破骨細(xì)胞形成過程中對RANKL誘導(dǎo)的基因表達(dá)的影響。用RT-PCR方法分析了不同劑量的光色素對RANKL和M-CSF作用5d后BMMS的基因表達(dá)水平。光色素干預(yù)后，破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因NFatc1、Fos、CTSK和Acp5的mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)。這些結(jié)果與光色素對破骨細(xì)胞分化和骨吸收的抑制作用是一致的。

4.光色素抑制NFATc1的活化和相關(guān)下游蛋白的表達(dá)

將轉(zhuǎn)染NFATc1熒光素酶報(bào)告基因的RAW264.7細(xì)胞與不同濃度的光色素聯(lián)合刺激以觀察光色素對RANKL誘導(dǎo)的NFATc1活性的影響。結(jié)果表明，在濃度為7.5和10μM的條件下，光色素能降低NFATc1熒光素酶活性。免疫印記分析在蛋白質(zhì)水平證實(shí)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。與抑制NFATc1的激活相一致，在第3天和第5天，光色素明顯阻斷了NFATc1蛋白的表達(dá)。另外，在10μM濃度下，c-Fos、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、組織蛋白酶K(CTSK)和整合素-β3等與NFATc1相關(guān)的下游蛋白表達(dá)也受到下調(diào)。

5.光色素能抑制RANKL誘導(dǎo)的NF-κB和MAPK通路的激活

眾所周知，RANKL誘導(dǎo)的NF-κB和MAPK信號通路在破骨細(xì)胞形成過程中起著重要作用。因此，發(fā)明人用熒光素酶報(bào)告法檢測了光色素對RANKL誘導(dǎo)的NF-κB活性的影響。經(jīng)過7.5和10μM光色素處理后，NF-kB熒光素酶的活性降低。免疫蛋白印記顯示RANKL誘導(dǎo)的IκB-α降解被抑制。有趣的是，光色素還抑制ERK1/2和p38的磷酸化，對STAT3和JNK1/2磷酸化作用不大。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，光色素抑制了RANKL誘導(dǎo)的NF-kB和MAPK信號通路的激活。

6.光色素抑制RANKL誘導(dǎo)的鈣離子振蕩

為解釋光色素對NFAT激活的抑制作用，發(fā)明人研究其對RANKL誘導(dǎo)的鈣離子信號傳導(dǎo)的影響。正如預(yù)期所想，與對照組相比，RANKL可激活鈣振蕩。光色素顯著降低RANKL誘發(fā)的鈣振蕩幅度。這些結(jié)果表明，光色素抑制了RANKL誘導(dǎo)的鈣信號通路，這與其對NFAT激活和RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成的抑制作用是一致的。

7.光色素提高了成骨細(xì)胞中ALP的表達(dá)

為進(jìn)一步研究光色素對成骨細(xì)胞分化和增殖的影響，發(fā)明人采用了MTS法檢測了光色素對成骨細(xì)胞的毒性作用。用不同劑量的光色素處理成骨細(xì)胞MC3T3-E124、48和120h。結(jié)果表明，在12μM和較低濃度下，光色素?zé)o細(xì)胞毒作用。在第7天觀察光色素對成骨細(xì)胞分化、堿性磷酸酶(ALP)活性和基因表達(dá)的影響。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，光色素處理組ALP的活性和基因表達(dá)增加。培養(yǎng)第28天，用茜素紅染色法測定成骨細(xì)胞礦化情況。結(jié)果表明，鈣沉積法評估的礦化作用在光色素干預(yù)后未發(fā)生變化。此外，在成骨細(xì)胞分化的早期階段(第7天)，光色素可促進(jìn)成骨細(xì)胞特異性基因Runx2和Col1a1的表達(dá)，但在第21天已恢復(fù)正常。在早期階段，光色素對成骨細(xì)胞的分化有促進(jìn)的作用。

主要參考資料

[1] 營養(yǎng)科學(xué)詞典

[2] CN201810881832.7光色素在制備治療骨丟失疾病藥物方面的應(yīng)用