背景[1-6]
ChIP-qPCR檢測服務可用于研究已知基因組結合位點處的蛋白質-DNA相互作用。如果位點未知，qPCR引物也可以針對潛在的調控區(qū)域(例如啟動子)進行設計。ChIP-qPCR在關注特定基因和潛在調控區(qū)域的研究中具有優(yōu)勢，因為qPCR的成本極低，可以在不同的實驗條件下進行。該技術現(xiàn)在用于各種生命科學學科，包括細胞分化，腫瘤抑制基因沉默以及組蛋白修飾對基因表達的影響等。
Chromatin Immnoprecipitation(ChIP)是研究體內DNA與蛋白質相互作用的一種技術。它在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質－DNA復合物，并將其隨機切斷為一定長度范圍內的染色質小片段，然后利用抗原抗體反應的特異性，特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，通過對目的片段的純化與檢測分析，獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。可以真實地反映體內蛋白因子與基因組DNA結合的狀況，當需要了解某特異的DNA結合蛋白所結合的DNA序列時，該技術是*好的方法；還可以對基因組中的組蛋白修飾進行分析定位，從而研究組蛋白的各種共價修飾與基因轉錄調控的關系。
ChIP-qPCR是利用熒光實時定量PCR檢測ChIP樣品的常用手段。ChIP-qPCR技術實現(xiàn)了在靶基因的啟動子上找到轉錄因子結合的直接證據(jù)，是細胞內真實的、原位的結果，同時可以比較與不同位點的結合能力的比較,相對于EMSA、luciferase報告載體等體外實驗驗證更具說服力。
實驗原理:
甲醛使DNA與其結合蛋白交聯(lián)，通過超聲波或酶處理，使染色質斷裂為小片段，加入特定抗體，對目的基因進行標記，免疫沉淀得到靶片段，解交聯(lián)得到基因片段，獲得的基因片段可用于后續(xù)PCR分析。
檢測流程
染色質準備→染色質剪切→染色質免疫沉淀→DNA純化→qPCR
ChIP是一種在活體內研究DNA和蛋白質相互作用的方法，廣泛用于多領域中染色質相關蛋白的研究。相比其他DNA與蛋白相互作用的研究方法，ChIP的突出優(yōu)勢在于通過檢測蛋白與DNA的結合，研究體內真實情況下的染色質結構，從而得出確鑿的誘導或阻礙轉錄的證據(jù)，這對構架信號調控網(wǎng)絡至關重要。
ChIP-Qpcr/PCR技術采用特定抗體來富集存在組蛋白修飾或轉錄調控具有直接作用的DNA片段。通過選擇自己感興趣的目的基因，設計特異性的引物，對特異性抗體（并設置相應的陽性對照和陰性對照和Input）免疫共沉淀后純化出的DNA片段進行PCR或qPCR進行驗證，高重復地半定量或定量生物樣品中特定轉錄因子/組蛋白修飾與已知基因啟動子的結合。
應用[7][8]
ChIP-qPCR檢測服務可用于腫瘤惡性行為的表觀遺傳分子機制研究：
MicroRNAs(miRNAs)是一類長度為21-25個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA,可以通過特異性地識別和結合3’-UTR區(qū)的互補序列,降解或抑制mRNA的翻譯來抑制靶基因的表達。它們廣泛參與了細胞分化、增殖、凋亡、組織器官發(fā)育等生理過程,也是腫瘤惡性行為的重要調控因子。因為miRNA在進化上的保守性和在細胞內作用的廣泛性,在各種腫瘤細胞中表達異常的miRNA,尤其是廣泛下調的抑癌性miRNA一直被認為是激活癌基因、促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要影響因子。
Wnt信號作為影響細胞生長發(fā)育的關鍵性通路,已被證實在很多腫瘤中異常表達,其中最常見的便是結腸癌。經(jīng)典的Wnt信號由細胞內抑癌基因APC的突變移除或致癌基因β-catenin的激活啟動,繼而通過β-catenin在細胞核內的聚積及其與轉錄因子TCF4的結合激活下游基因c-Myc和CCND1等的轉錄。除這一經(jīng)典的轉錄激活作用外,不少研究也證實了TCF4單獨或與β-catenin一起對Wnt通路下游基因的轉錄抑制作用。
在這些受調控的基因中,近期研究報道了miRNA作為轉錄后調控因子,也分布在Wnt通路的調控網(wǎng)絡中。通過分析TCF4在HCT116細胞中的ChIP-seq數(shù)據(jù)庫、干擾內源性TCF4表達以及對候選miRNA啟動子區(qū)的ChIP-qPCR檢測,確定要研究的被Wnt信號調控的miRNA;在激活和抑制Wnt信號的情況下,用qPCR檢測該miRNA的表達以確定調控關系;通過ChIP-qPCR檢測該miRNA啟動子區(qū)是否有Wnt信號核心轉錄復合物TCF4-β-catenin的結合富集。
參考文獻
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[8]王微.Wnt信號調控結腸癌惡性行為的表觀遺傳分子機制[D].中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學,2018.