背景^[1-6]

熒光定量PCR引物是指在核苷酸聚合作用起始時(shí)，刺激合成的一種具有特定核苷酸序列的大分子，與反應(yīng)物以共價(jià)鍵形式連接，這樣的分子稱為引物。引物通常是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個(gè)引物與靶區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ)，另一個(gè)引物與靶區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ)，其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點(diǎn)，核酸聚合酶可由其3端開(kāi)始合成新的核酸鏈。

體外人工設(shè)計(jì)的引物被廣泛用于聚合酶鏈反應(yīng)、測(cè)序和探針合成等。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是利用熒光染料（具有雙鏈DNA親和性）或熒光標(biāo)記短核苷酸探針（利用Taq酶的5’→3’外切酶活性）的熒光活性，在PCR反應(yīng)的的過(guò)程中，每個(gè)循環(huán)收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)。隨著PCR反應(yīng)產(chǎn)物量的增加，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增強(qiáng)。RT-qPCR反應(yīng)完成后通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)后熒光信號(hào)強(qiáng)度變化的監(jiān)測(cè)可得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖，進(jìn)一步可計(jì)算出相對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物量的變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析。

引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個(gè)引物與目的基因一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ)，另一個(gè)引物與目的基因另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ)。在PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根據(jù)這一序列合成引物，利用PCR擴(kuò)增技術(shù)，目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈，引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合，然后在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸，如此重復(fù)循環(huán)，延伸后得到的產(chǎn)物同樣可以和引物結(jié)合。

PCR引物設(shè)計(jì)的目的是找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。如前述，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。對(duì)引物的設(shè)計(jì)不可能有一種包羅萬(wàn)象的規(guī)則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設(shè)計(jì)。

引物設(shè)計(jì)有3條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)，其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，再次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。

具體實(shí)現(xiàn)這3條基本原則需要考慮到諸多因素，如引物長(zhǎng)度（primer length），產(chǎn)物長(zhǎng)度（product length），序列Tm值(melting temperature)，引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性(internal stability,用?G值反映)。

形成引物二聚體(primer dimer)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplexformation and hairpin）的能值，在錯(cuò)配位點(diǎn)（false priming site）的引發(fā)效率，引物及產(chǎn)物的GC含量（composition），等等。必要時(shí)還需對(duì)引物進(jìn)行修飾，如增加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，引進(jìn)突變等。

應(yīng)用^[7][8]

熒光定量PCR引物可用于熒光定量PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)：

熒光定量PCR方法為技術(shù)基礎(chǔ),建立了一種能單管同時(shí)鑒別三種動(dòng)物衣原體的TaqMan-MGB探針多重?zé)晒舛縋CR方法,該方法特異、靈敏且穩(wěn)定性良好。主要研究?jī)?nèi)容包括以下幾方面：

1、通過(guò)對(duì)GenBank中衣原體科的9種衣原體主要外膜蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析,應(yīng)用Primer Express3.0生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)了3對(duì)特異的引物,3條探針和1對(duì)通用引物。采用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,構(gòu)建陽(yáng)性質(zhì)粒,將其陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與GenBank中已發(fā)表的主要外膜蛋白序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明：構(gòu)建的陽(yáng)性質(zhì)粒與GenBank中發(fā)表的主要外膜蛋白序列相似性分別達(dá)達(dá)99%、97%、96%。

2、通過(guò)對(duì)三種衣原體(家畜嗜衣原體、流產(chǎn)嗜衣原體、鸚鵡熱衣原體)的單重?zé)晒舛縋CR引物濃度、探針濃度和Tm值的優(yōu)化,分別建立了家畜嗜衣原體、流產(chǎn)嗜衣原體、鸚鵡熱衣原體的單重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法。并進(jìn)行了相應(yīng)的特異性試驗(yàn)、靈敏度試驗(yàn),建立了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。動(dòng)物衣原體病((Chlamydiosis)是由各類衣原體(Chlamydia)感染哺乳動(dòng)物、禽類等動(dòng)物所發(fā)生的一類十分重要的自然疫源性傳染病。該病呈地方流行,常造成較大的危害及經(jīng)濟(jì)損失。

目前針對(duì)的衣原體的檢測(cè)方法有細(xì)胞培養(yǎng)法、間接血凝試驗(yàn)(1HA)、直接染色觀察等方法,但以上檢測(cè)方法對(duì)于快速準(zhǔn)確的檢測(cè)衣原體尚存在較大的局限,如細(xì)胞培養(yǎng)法容易受到支原體的污染、靈敏度較低；間接血.凝試驗(yàn)雖然操作比較簡(jiǎn)單,但批次間差異較大、陽(yáng)性檢出率較低；直接染色觀察靈敏度較低。因此,急需建立一種快速、簡(jiǎn)捷、特異、靈敏、穩(wěn)定性好的檢測(cè)方法,用于衣原體的早期診斷、疫情監(jiān)控、流行病學(xué)調(diào)查等。

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