背景^[1-6]

熒光定量PCR分析服務(wù)是通過熒光定量PCR對相關(guān)基因位點(diǎn)及其表達(dá)水平進(jìn)行檢測的技術(shù)性服務(wù)。實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。Real-timePCR是在PCR擴(kuò)增過程中，通過熒光信號，對PCR進(jìn)程進(jìn)行實時檢測。

由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。所謂實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

原理：將標(biāo)記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后，完成高溫變性，低溫復(fù)性，適溫延伸的熱循環(huán)，并遵守聚合酶鏈反應(yīng)規(guī)律，與模板DNA互補(bǔ)配對的Taqman探針被切斷，熒光素游離于反應(yīng)體系中，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，被擴(kuò)增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長，通過實時檢測與之對應(yīng)的隨擴(kuò)增而變化熒光信號強(qiáng)度，求得Ct值，同時利用數(shù)個已知模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作對照，即可得出待測標(biāo)本目的基因的拷貝數(shù)。

檢測方法

1.SYBRGreenⅠ法：

在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。

SYBR定量PCR擴(kuò)增熒光曲線圖

PCR產(chǎn)物熔解曲線圖（單一峰圖表明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的單一性）

2.TaqMan探針法：

探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。

應(yīng)用^[7][8]

熒光定量PCR分析服務(wù)可結(jié)合生物芯片技術(shù)用于疾病快速診斷：

生物芯片技術(shù)是20世紀(jì)末發(fā)展起來的一項新技術(shù)。生物芯片是在微小面積上，利用微加工技術(shù)，并結(jié)合有關(guān)的化學(xué)合成技術(shù)制造而成的一種具有一定分子生物學(xué)檢驗功能的微型器件。分析和解釋生物芯片上得到的信息，將在DNA結(jié)構(gòu)與功能之間架起一道橋梁，進(jìn)而推進(jìn)生命科學(xué)的迅速發(fā)展。

首次將實時熒光PCR技術(shù)與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合，設(shè)計了一款實時熒光PCR芯片。在此芯片中設(shè)計了一個壩狀結(jié)構(gòu)，芯片鍵合封裝后在壩下面會形成一個1um的罅縫，此罅縫能從血液中分離出白細(xì)胞，細(xì)胞分離后再往此芯片中注入PCR反應(yīng)液，實現(xiàn)在同一腔體中進(jìn)行PCR反應(yīng)。由于它在很小的腔體內(nèi)進(jìn)行PCR反應(yīng)，能大大節(jié)省樣品和試劑的使用量。

在此芯片上利用微加工技術(shù)，集成制作了微加熱器和溫度傳感器。由于芯片本身是由硅片和玻璃片經(jīng)陽極鍵合而成，有非常好的導(dǎo)熱效果，而且沒有使用具有較大熱容的外置加熱器件，從而提高了PCR反應(yīng)的升降溫速度，縮短了PCR反應(yīng)總時間。加熱器和溫度傳感器的集成化，使得我們設(shè)計的芯片溫控、熒光檢測平臺得以微型化。

同時自主設(shè)計了針對此芯片的專用檢測平臺，該平臺由注射泵系統(tǒng)、實時熒光信號采集系統(tǒng)和PCR溫度控制系統(tǒng)等組成，能實現(xiàn)樣品進(jìn)樣，PCR溫度控制，實時熒光檢測、檢測結(jié)果分析及處理等功能。最后，將此實時熒光PCR芯片及其檢測平臺應(yīng)用于強(qiáng)直性脊柱炎相關(guān)基因HLA-B27的檢測，實驗證明該芯片系統(tǒng)能快速準(zhǔn)確的檢測出血液中的HLA-B27基因，從而驗證了此芯片系統(tǒng)的實用價值。

參考文獻(xiàn)

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