背景^[1-6]

凋亡PCR芯片檢測運用高通量熒光定量PCR方法，在一張96孔或384孔板上同時對某個信號通路或疾病相關(guān)基因的表達(dá)量變化進行檢測，芯片上的基因包括了與研究對象有確定關(guān)系的基因或者待考證的基因。細(xì)胞凋亡ARRAY含有84個與人細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因，包括促凋亡基因，抗凋亡基因，細(xì)胞損傷基因，凋亡調(diào)節(jié)基因等。

實時定量PCR是檢測基因表達(dá)最靈敏、最可靠的方法，但只能檢測少數(shù)幾個基因的表達(dá)水平。若要檢測大量基因，則工作量巨大，耗時長久。PCR芯片，克服了這一缺點，可同時進行多種基因檢測，還可以節(jié)省數(shù)據(jù)分析時間，使研究者可以在更短的時間內(nèi)得到更豐富的信息。

PCR芯片可廣泛用于生命科學(xué)、生物技術(shù)、疾病檢測、臨床醫(yī)學(xué)和環(huán)境檢測等領(lǐng)域，是近年生命科學(xué)領(lǐng)域常用的研究手段之一。隨著研究的的段進展，需要研究的基因也在不斷地更新?lián)Q代，找到一張適合自己的PCR芯片，也就成為了實驗成功的關(guān)鍵。

生物體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，不但依賴細(xì)胞增殖和分化，也依賴于細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡（apoptosis）又稱編程性死亡，是生物界重要的生命現(xiàn)象之一。從線蟲至高等哺乳類動物，從胚胎至成人，從生理到病理，從生到死整個過程，體內(nèi)不同的細(xì)胞多具有此種死亡形式。早在100多年前Carl Vogt已發(fā)現(xiàn)這種死亡形式。1972年Kerr等人重新提出研究，并命名為凋亡（apoptosis）。

其后在凋亡的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)等領(lǐng)域取得新的認(rèn)識。細(xì)胞凋亡PCR芯片有96孔和384孔兩種規(guī)格，可以同時對幾十到幾百個與某一主題相關(guān)的基因進行分析。產(chǎn)品采用SYBR Green實時熒光PCR方法。以96孔PCR芯片為例，基因?qū)Ｒ恍砸镆逊謩e固定在96孔PCR芯片中。只需要將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生的cDNA與PCR master mix混合，再將混合物分配到PCR板的96個孔位，進行實時熒光PCR反應(yīng)，就能輕松獲得91個相關(guān)基因的表達(dá)情況。

應(yīng)用2塊96孔PCR芯片分別對實驗樣品和對照樣品進行分析，就能對91個基因的表達(dá)進行相對定量。每一塊96孔PCR芯片設(shè)有4個看家基因?qū)φ眨?beta;-actin,GAPDH,18S,28S），以方便在實驗下選擇穩(wěn)定表達(dá)的參比基因，用于基因表達(dá)相對定量。每塊PCR芯片還設(shè)有一個PCR陽性對照（Positive Control）。PCR陽性對照用于質(zhì)控PCR反應(yīng)。

應(yīng)用^[7][8]

凋亡PCR芯片檢測可用于檢測凋亡信號通路的相關(guān)基因表達(dá)：

結(jié)直腸癌(colorectal carcinoma,CRC)是我國前三位最常見的惡性腫瘤,同時也是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的主要原因之一,近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢。雖然在結(jié)直腸癌發(fā)病初期,90%的病人可手術(shù)治療治愈,可是大部分病人在確診時已是癌癥晚期,預(yù)后極差。CRIP1是LIM家族成員,蛋白分子量8kDa,屬于小分子量蛋白,已經(jīng)有研究結(jié)果表明,CRIP1在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌及胰腺癌中高表達(dá),并對疾病的預(yù)后有重要影響,而在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及功能還不甚清楚,本課題立意研究CRIP1對結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的影響及調(diào)控機制,爭取為結(jié)直腸癌的有效治療找到新的靶點或途徑。

方法1.分析CRIP1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況,通過實時定量PCR法檢測CRIP1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的mRNA水平,免疫印跡檢測其蛋白表達(dá)水平,以及免疫組化探索在結(jié)直腸癌組織及癌周組織的表達(dá)情況;2.構(gòu)建CRIP1過表達(dá)載體,通過瞬時轉(zhuǎn)染后CCK8及EDU增殖實驗研究過表達(dá)CRIP1后對SW620細(xì)胞增殖能力的影響,采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況,并同時采用Tunel細(xì)胞成像實驗檢測細(xì)胞的凋亡。

另采用5-氟尿嘧啶(5-FU)處理細(xì)胞,觀察CRIP1過表達(dá)對藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響;3.構(gòu)建CRIP1干擾片段,采用上述相同研究方案進行驗證;4.免疫印跡探究CRIP1對凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)控情況,特別是對結(jié)直腸癌細(xì)胞Fas和FasL的表達(dá)調(diào)控關(guān)系,其中FasL的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測定,后利用流式細(xì)胞儀及細(xì)胞成像法進行恢復(fù)試驗驗證CRIP1在Fas/FasL通路調(diào)控中的關(guān)鍵作用;5.探究CRIP1對Fas的調(diào)控機制,使用熒光定量RT-PCR及免疫印跡探究CRIP1對Fas在mRNA水平及蛋白水平的影響,然后通過免疫共沉淀實驗(CO-IP)對CRIP1及Fas之間相互作用及泛素化調(diào)控機制進行探究。

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