背景^[1-6]

人細(xì)胞自噬PCR芯片運(yùn)用高通量熒光定量PCR方法，在一張96孔或384孔板上同時對某個信號通路或疾病相關(guān)基因的表達(dá)量變化進(jìn)行檢測，芯片上的基因包括了與研究對象有確定關(guān)系的基因或者待考證的基因；目前針對不同的信號通路和疾病相關(guān)基因設(shè)計(jì)了150多款功能分類PCR芯片，涵蓋生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域。

人細(xì)胞自噬PCR芯片可用于研究參與自噬反應(yīng)的84個關(guān)鍵基因的表達(dá)。自噬是一種細(xì)胞內(nèi)的代謝過程，是通過溶酶體吞噬細(xì)胞中的受損蛋白和細(xì)胞器的過程。自噬作用已經(jīng)被證明與很多正常的生理過程有關(guān)，如能量代謝、細(xì)胞器翻轉(zhuǎn)、生長調(diào)節(jié)和老化。自噬受損將會導(dǎo)致心肌疾病和癌癥等。該一芯片包含了與細(xì)胞內(nèi)外信號通路有關(guān)的自噬的分子基因，及其關(guān)鍵調(diào)控因子基因。通過實(shí)時定量PCR的方法，研究者即能夠利用該芯片簡單可靠地同時檢測自噬相關(guān)基因的表達(dá)。

細(xì)胞自噬(autophagy or autophagocytosis)：又稱為Ⅱ型細(xì)胞死亡，是細(xì)胞在自噬相關(guān)基因(autophagyrelated gene，Atg)的調(diào)控下利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程。目前發(fā)現(xiàn)自噬在重要的生物過程中，如細(xì)胞生長、細(xì)胞分化、天然和適應(yīng)性免疫、老化和細(xì)胞死亡等都發(fā)揮著很重要的作用。

人細(xì)胞自噬ARRAY含有84個與人細(xì)胞自噬相關(guān)的基因，包括形成自噬組件和自噬調(diào)節(jié)因子兩大部分，其中形成自噬組件的有：參與自噬性空泡形成的基因，負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)靶向膜/真空的基因，負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的基因，將自噬體與溶酶體連接的基因，參與蛋白質(zhì)泛素化的基因和具有蛋白酶活性的基因；參與自噬調(diào)節(jié)的基因有：自噬和細(xì)胞凋亡的共調(diào)節(jié)因子，自噬和細(xì)胞周期的共調(diào)節(jié)因子，細(xì)胞內(nèi)病原體自噬誘導(dǎo)，響應(yīng)于其他細(xì)胞內(nèi)信號的自噬和伴侶介導(dǎo)的自噬。

應(yīng)用^[7][8]

人細(xì)胞自噬PCR芯片可用于細(xì)胞自噬信號通路研究：

在ATF6在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的HepG2細(xì)胞自噬與凋亡中作用機(jī)制的研究中活化轉(zhuǎn)錄因子6(Activating Transcription Factor6,ATF6)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種感受蛋白,是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡和自噬途徑中的一個重要的調(diào)節(jié)因子。盡管隨著研究的深入對其調(diào)控機(jī)制已經(jīng)取得了一些進(jìn)展,但其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的凋亡和自噬中的具體調(diào)控機(jī)制尤其是腫瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制還不是很清楚。

因此,本研究以人肝癌HepG2細(xì)胞為研究對象,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下,探討ATF6在細(xì)胞凋亡和自噬中的作用以及由其介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑,為進(jìn)一步闡明ATF6在凋亡與自噬中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時,為腫瘤治療研究提供新的作用靶點(diǎn)。應(yīng)用QRT-PCR和Western blot方法對與凋亡和自噬有關(guān)的mRNA和蛋白水平進(jìn)行檢測,驗(yàn)證iTRAQ篩選差異蛋白結(jié)果；并分別用Blebbistatin、SB203580和Dynasore作為MYH9、HSPB1和DynaminⅡ的抑制劑,Western blot檢測自噬和凋亡相關(guān)蛋白的變化。

iTRAQ數(shù)據(jù)顯示,共篩選到差異蛋白106個,其中有52種蛋白表達(dá)上調(diào),54種蛋白表達(dá)下調(diào)。生物信息學(xué)分析表明,在這些差異蛋白中有許多與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)；其中有24種蛋白與凋亡和自噬有關(guān)。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明,我們所挑選的基因和蛋白的變化趨勢與iTRAQ結(jié)果中差異蛋白的變化趨勢基本相一致。應(yīng)用Blebbistatin和Dynasore并聯(lián)合ATF6高表達(dá)后,凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)均升高,Bax表達(dá)量則顯著下降；自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ和Beclin1的表達(dá)量顯著降低,p62的表達(dá)量則上升。

應(yīng)用SB203580并聯(lián)合ATF6高表達(dá)后,Bcl-2、LC3Ⅱ和Beclinl的表達(dá)量明顯下降,Bax和p62的表達(dá)量則顯著上升。以上結(jié)果表明,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下,MYH9、HSPB1和DynaminⅡ三個蛋白可能參與了ATF6介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬過程。

綜上所述,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡和自噬。ATF6能夠促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的凋亡和自噬,其調(diào)控凋亡的作用機(jī)制與線粒體途徑有關(guān),而DAPK1-Beclinl這一通路的激活參與了其調(diào)控自噬的過程。MYH9、HSPB1和DynaminⅡ三個蛋白均在ATF6介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬過程中發(fā)揮了重要的作用,可作為研究ATF6調(diào)節(jié)凋亡和自噬作用機(jī)制的分子靶點(diǎn)。

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