背景[1-6]
人細(xì)胞凋亡PCR芯片可用于研究參與細(xì)胞程序性死亡的84個關(guān)鍵基因的表達(dá)。細(xì)胞凋亡在正常生物過程中發(fā)揮重要作用，如分化、發(fā)育和體內(nèi)平衡。應(yīng)激反應(yīng)，如熱休克、缺血、非折疊蛋白和病毒感染，會引起細(xì)胞嚴(yán)重受損甚至細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡經(jīng)常導(dǎo)致不可控的細(xì)胞生長，如腫瘤形成和癌癥；同時腫瘤壞死因子（TNF）受體也會通過激活FADD和其他死亡受體蛋白引起凋亡。
這一芯片包含了TNF配體及受體、bcl-2、半胱天冬酶、IAP、TRAF、CARD、死亡域、死亡效應(yīng)域、CIDE家族，以及參與p53和DNA損傷通路的基因。研究這些基因的表達(dá)有助于確定在生物模型和細(xì)胞模型中的細(xì)胞機制。通過實時定量PCR的方法，研究者即能夠利用該芯片簡單可靠地同時檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。
實時定量PCR是檢測基因表達(dá)最靈敏、最可靠的方法，但只能檢測少數(shù)幾個基因的表達(dá)水平。若要檢測大量基因，則工作量巨大，耗時長久。PCR芯片，克服了這一缺點，可同時進(jìn)行多種基因檢測，還可以節(jié)省數(shù)據(jù)分析時間，使研究者可以在更短的時間內(nèi)得到更豐富的信息。PCR芯片可廣泛用于生命科學(xué)、生物技術(shù)、疾病檢測、臨床醫(yī)學(xué)和環(huán)境檢測等領(lǐng)域，是近年生命科學(xué)領(lǐng)域常用的研究手段之一。
隨著研究的的段進(jìn)展，需要研究的基因也在不斷地更新?lián)Q代，找到一張適合自己的PCR芯片，也就成為了實驗成功的關(guān)鍵。細(xì)胞凋亡PCR芯片有96孔和384孔兩種規(guī)格，可以同時對幾十到幾百個與某一主題相關(guān)的基因進(jìn)行分析。
產(chǎn)品采用SYBR Green實時熒光PCR方法。以96孔PCR芯片為例，基因?qū)Ｒ恍砸镆逊謩e固定在96孔PCR芯片中。只需要將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生的cDNA與PCR master mix混合，再將混合物分配到PCR板的96個孔位，進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)，就能輕松獲得91個相關(guān)基因的表達(dá)情況。應(yīng)用2塊96孔PCR芯片分別對實驗樣品和對照樣品進(jìn)行分析，就能對91個基因的表達(dá)進(jìn)行相對定量。每一塊96孔PCR芯片設(shè)有4個看家基因?qū)φ眨?beta;-actin,GAPDH,18S,28S），以方便在實驗下選擇穩(wěn)定表達(dá)的參比基因，用于基因表達(dá)相對定量。每塊PCR芯片還設(shè)有一個PCR陽性對照（Positive Control）。PCR陽性對照用于質(zhì)控PCR反應(yīng)。
PCR芯片的優(yōu)點：
簡單快捷：可同時檢測幾十到幾百個基因；
靈敏度高：樣本要求低，總RNA最少可為0.5ng；
重復(fù)性高：Ct值的平均差異只有1個循環(huán)；
數(shù)據(jù)全面、可靠：芯片包含的基因來自公共權(quán)威數(shù)據(jù)庫、權(quán)威綜述和相關(guān)文獻(xiàn)挖掘；
PCR芯片主要實驗流程
1.樣品RNA抽提
2.DNase I消化RNA樣品
3.RNA純化
4.RNA質(zhì)量檢測
5.cDNA合成
6.實時定量PCR
按照芯片說明將cDNA模板適當(dāng)稀釋后加入到實時定量PCR反應(yīng)混合液中，然后在含有基因特異性引物的96孔板各孔中加入等量反應(yīng)液，進(jìn)行實時定量PCR反應(yīng)。
7.數(shù)據(jù)分析
利用配套軟件計算PCR芯片中的各個基因的Ct值，采用公認(rèn)的ΔΔCt方法比較基因的表達(dá)變化。
應(yīng)用[7][8]
人細(xì)胞凋亡PCR芯片可用于細(xì)胞凋亡信號通路研究：
腫瘤細(xì)胞釋放自噬小體(TRAP)通過TLR2-MyD88-NF-κB信號途徑誘導(dǎo)B細(xì)胞成為分泌高水平IL-10的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(IL-10~+Breg細(xì)胞),并依賴IL-10抑制T細(xì)胞的活化及其抗腫瘤作用;同時發(fā)現(xiàn):TRAP能通過TLR4-MyD88-p38信號通路誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞成為高表達(dá)PD-L1和IL-10的M2樣巨噬細(xì)胞,并通過PD-L1/PD-1和IL-10抑制T細(xì)胞的活化及其抗腫瘤作用。
但是,TRAP是否能夠調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞功能并在腫瘤免疫中發(fā)揮相應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)作用,有待進(jìn)一步研究。目的:探討腫瘤細(xì)胞釋放自噬小體(TRAP)是否調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)行為,研究TRAP誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡的分子機制,初步探討吞噬TRAP的中性粒細(xì)胞是否對T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞具有調(diào)節(jié)作用及其機制。
腫瘤細(xì)胞釋放自噬小體(TRAP)調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)行為的研究中性粒細(xì)胞能夠快速大量地吞噬TRAP,TRAP可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡。與DNase I和RNase A處理的TRAP相比,Proteinase K處理的TRAP誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡的比例明顯減少。與膜結(jié)構(gòu)完整的TRAP相比,膜破碎的TRAP不能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡。
參考文獻(xiàn)
[1]Neutrophils,G‐CSF and their contribution to breast cancer metastasis[J].Kellie A.Mouchemore,Robin L.Anderson,John A.Hamilton.The FEBS Journal.2018(4)
[2]Neutrophils in cancer:prognostic role and therapeutic strategies[J].Alberto Ocana,Cristina Nieto-Jiménez,Atanasio Pandiella,Arnoud J Templeton.Molecular Cancer.2017(1)
[3]Paneth cells secrete lysozyme via secretory autophagy during bacterial infection of the intestine[J].Shai Bel,Mihir Pendse,Yuhao Wang,Yun Li,Kelly A.Ruhn,Brian Hassell,Tess Leal,Sebastian E.Winter,Ramnik J.Xavier,Lora V.Hooper.Science.2017(6355)
[4]Cancer-promoting mechanisms of tumor-associated neutrophils[J].Brian Hurt,Richard Schulick,Barish Edil,Karim C.El Kasmi,Carlton Barnett.The American Journal of Surgery.2017
[5]Interleukin-17–Producing Neutrophils Link Inflammatory Stimuli to Disease Progression by Promoting Angiogenesis in Gastric Cancer[J].Tuan-Jie Li,Yu-Ming Jiang,Yan-Feng Hu,Lei Huang,Jiang Yu,Li-Ying Zhao,Hai-Jun Deng,Ting-Yu Mou,Hao Liu,Yang Yang,Qi Zhang,Guo-Xin Li.Clinical Cancer Research.2017(6)
[6]Neutrophils in cancer[J].Louise W.Treffers,Ida H.Hiemstra,Taco W.Kuijpers,Timo K.Berg,Hanke L.Matlung.Immunological Reviews.2016(1)
[7]Insulin-degrading enzyme secretion from astrocytes is mediated by an autophagy-based unconventional secretory pathway in Alzheimer disease[J].Sung Min Son,Moon-Yong Cha,Heesun Choi,Seokjo Kang,Hyunjung Choi,Myung-Shik Lee,Sun Ah Park,Inhee Mook-Jung.Autophagy.2016(5)
[8]高蓉.腫瘤細(xì)胞釋放自噬小體（TRAP）誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡及其生物學(xué)功能的機制研究[D].東南大學(xué),2018.