背景^[1-6]

非凍型血液DNA保存液在室溫條件下長期保存用于DNA提取的血液樣品的保存液。它通過裂解細胞并高效抑制DNase的活性而達到長期保證DNA分子的完整性的效果。

操作流程：

1.非凍型血液DNA保存液250mL成分根據(jù)要保存的各樣本的體積，計算出所需RNAwait用量。RNAwait的用量應(yīng)當(dāng)是組織體積的10倍（如100mg組織約用1ml RNAwait）；離心收集2×106細胞RNAwait的用量是1ml。

2.將RNAwait按需要量分裝入自備保存管中；

3.保存時先將樣本浸入RNAwait后置4℃冰箱過夜（4℃過夜是必需的，這樣可使RNAwait完全滲入到組織中），然后轉(zhuǎn)移到-20℃冰箱（RNAwait在-20℃時仍為液態(tài)，有結(jié)晶析出，是正常情況）；或者在4℃冰箱過夜后，從RNAwait中取出組織塊，轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱。在RNAwait中保存的標(biāo)本，反復(fù)凍融至室溫20次不影響RNA的質(zhì)量。

產(chǎn)品特點：

1.非凍型血液DNA保存液250mL成分操作簡單,將組織剪薄浸沒在RNAWAIT中即可使其RNA不被降解。

2.替代液氮,使樣品的保存不需液氮,干冰或-80℃冰箱,尤其適用于臨床和野外樣品的快速和大規(guī)模采集。

完整,因RNAwait能迅速抑制組織中RNA酶的活性,故從中提取的RNA的質(zhì)量跟液氮保存的樣品相比不相上下。

4.方便運輸,處理過的樣品能在25℃保存一周,使樣品郵寄和運輸變得容易和便宜,有利學(xué)術(shù)合作和交流。

5.反復(fù)凍融,經(jīng)RNAwait處理的樣品可反復(fù)凍融20次,其間可對樣品進行各種處理而不影響最終提取的RNA的質(zhì)量。

6.結(jié)果準確,RNAwait進入細胞十分快速,基因表達在發(fā)生應(yīng)急改變前就得以鎖定,故RNA分析更能反映取樣時的真況。

7.可比性強,RNAwait能減少大規(guī)模樣品處理中的誤差,增加各次實驗數(shù)據(jù)間的可比性,對大規(guī)?；虮磉_譜的分析尤其有用。

8.兼容性廣,處理過的樣品可以使用TRIzol等試劑提取其RNA,樣品還可直接用于組織切片,免疫學(xué)和流式細胞分析而不影響RNA的質(zhì)量。

應(yīng)用^[7][8]

非凍型血液DNA保存液可用于血液循環(huán)DNA長期保存：

循環(huán)DNA（circulating DNA），又稱為游離DNA（cell-free DNA），是存在于血液（血漿或血清）、腦脊液以及滑膜液等體液中的細胞外DNA。隨著微量DNA定量檢測技術(shù)的飛速發(fā)展，循環(huán)DNA，特別是血液循環(huán)DNA，作為一種微創(chuàng)檢查中的生物大分子標(biāo)志物，日益受到人們的關(guān)注。人血液循環(huán)DNA含量的變化在多種類型疾病的診斷、療效觀察和預(yù)后判斷中具有重要價值。

然而，由于血液采集、分離、保存方式和樣本選擇的不同，以及循環(huán)DNA提取、純化和定量方法的差異，各研究結(jié)果間缺乏可比性，目前關(guān)于健康人血液循環(huán)DNA水平和正常參考值范圍，尚未見大樣本的研究報道。目的建立含有內(nèi)參照物的血液循環(huán)DNA定量檢測方法，對健康人血液循環(huán)DNA水平進行初步研究，確定其正常參考值范圍。方法自行設(shè)計并合成人工雙鏈DNA片段，重組到pMD18-T質(zhì)粒載體中，經(jīng)基因克隆和多步篩選實驗，構(gòu)建重組質(zhì)粒，提取質(zhì)粒DNA，紫外分光光度法對其進行定量，梯度稀釋獲得標(biāo)準內(nèi)參照物。

通過比較四種不同的DNA提取方法對重組質(zhì)粒DNA的提取效率，選擇合適的血液循環(huán)DNA提取方法。采用實時熒光定量PCR技術(shù)，以三條引物（共用一條下游引物）和兩條Taqman熒光探針，同時擴增血漿和血清中的目的基因（人看家基因β-actin）和內(nèi)參照物（重組質(zhì)粒DNA），以擴增效率為指標(biāo)，確定雙重實時熒光定量PCR反應(yīng)中的Mg2+和下游引物的濃度。

由已知的標(biāo)準內(nèi)參照物濃度計算得到目的基因的濃度。針對不同的血漿血清用量（200、100、50、10、2和1μl）進行定量檢測，確定該方法的敏感性。以紫外分光光度法定量的人基因組DNA投入空白血漿和血清中，以雙重實時熒光定量PCR進行定量檢測，確定其準確性。針對不同程度稀釋的血漿血清DNA樣品進行定量檢測，確定檢測方法的穩(wěn)定性，并對該檢測方法的重復(fù)性進行評價。

參考文獻

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