背景^[1-6]

Necrostatin-1(TNF-alpha抑制劑)是一種有效，選擇性和可滲透細(xì)胞的壞死性凋亡(necroptosis)抑制劑，在Jurkat細(xì)胞中的EC50為490 nM。它通過(guò)抑制壞死性凋亡途徑中的死亡域受體激酶RIP(RIP1)起作用。Necrostatin-1(1-100μM)抑制過(guò)表達(dá)和內(nèi)源性的RIP1發(fā)生自磷酸化。RIP1是初級(jí)細(xì)胞靶點(diǎn)，負(fù)責(zé)Necrostatin-1的抗細(xì)胞壞死活性。Necrostatin-1有效抑制多種類型細(xì)胞觸發(fā)的壞死性細(xì)胞死亡。

Necrostatin-1作為細(xì)胞壞死的小分子抑制劑,作用于jurkat細(xì)胞，抑制RIP激酶的誘導(dǎo)細(xì)胞壞死，抑制TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死，EC50為490 nM。傳統(tǒng)意義上，細(xì)胞死亡分為調(diào)控型（凋亡，apoptosis）和非調(diào)控型（壞死，necrosis）兩種。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)壞死也可以受調(diào)控，即一種新型的細(xì)胞死亡機(jī)制，稱為壞死性凋亡（necroptosis）。凋亡，也稱為程序性細(xì)胞死亡（PCD）或自殺性細(xì)胞死亡，被認(rèn)為是一種基因控制、高度有序的細(xì)胞自主死亡，由一系列信號(hào)事件組成的通路。

細(xì)胞在一定的生理或病理狀態(tài)下，遵循自身的程序，自己結(jié)束自己生命的過(guò)程，最后細(xì)胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體，并迅速被周圍專職或非專職吞噬細(xì)胞吞噬，不會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。壞死或壞死性細(xì)胞死亡，是由非特異性和非生理壓力誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種偶然且非調(diào)控、被動(dòng)的細(xì)胞死亡。由于缺乏普通的生化共因，壞死大體仍被歸類為消極因素，沒(méi)有凋亡或自吞噬標(biāo)志物。

現(xiàn)今，壞死的形態(tài)學(xué)特征有：細(xì)胞容積增大（脹亡）、細(xì)胞器膨脹、質(zhì)膜破損和隨后一系列的細(xì)胞內(nèi)含物流失。壞死性凋亡，一種受調(diào)控發(fā)生的壞死，具有以下特征：1）具有壞死樣表征的細(xì)胞死亡有助于維持胚胎發(fā)育和成年組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)；2）壞死樣細(xì)胞死亡可以通過(guò)配體結(jié)合到其特異性膜受體而被誘導(dǎo)產(chǎn)生；3）壞死可以被遺傳、表觀遺傳以及藥理學(xué)因素來(lái)調(diào)控；4）caspase的失活可使凋亡轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂械蛲鰳雍蛪乃罉踊旌咸卣鞯募?xì)胞死亡或完全性壞死。壞死性凋亡的發(fā)生取決于RIP1（受體相互蛋白1）的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，可通過(guò)RIP1活性抑制而被阻斷。

越來(lái)越多的研究表示，壞死性凋亡是一種重要的細(xì)胞死亡機(jī)制，在腦缺血、心急缺血、急性和慢性神經(jīng)退行性疾病、腫瘤等多種人類病理活動(dòng)中具重要作用。Necrostatin-1（Nec-1），一種特異性且強(qiáng)效的壞死性凋亡（necroptosis）抑制劑，區(qū)別于自發(fā)凋亡（apoptosis）的一種程序性死亡機(jī)制，不會(huì)對(duì)Fas/TNFR激發(fā)的經(jīng)典自發(fā)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生任何干擾。Nec-1是一種ATP競(jìng)爭(zhēng)性的受體相互作用蛋白激酶1（receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1,RIP1 kinase）變構(gòu)抑制劑（EC50=180 nM），該蛋白是參與壞死性凋亡激活途徑至關(guān)重要的一種上游激酶。小鼠的中風(fēng)模型中，Nec-1能夠降低再灌注引起的腦損傷。

應(yīng)用^[7][8]

Necrostatin-1(TNF-alpha抑制劑)可用于細(xì)胞死亡機(jī)制研究：

necrostatin-1與受體相互作用蛋白激酶1（receptorinteraction protein kinase1,RIP1）及受體相互作用蛋白激酶3（receptor interactionprotein kinase3,RIP3）在谷氨酸誘導(dǎo)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）與海馬神經(jīng)元（HT22）毒性中發(fā)揮的作用。用谷氨酸或TNF-誘導(dǎo)后，檢測(cè)野生型及RIP3缺失型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）以及HT22細(xì)胞的存活率，以探明它們對(duì)谷氨酸或TNF-的敏感度。

通過(guò)siRNA干擾將TNF-誘導(dǎo)的壞死通路中的關(guān)鍵蛋白R(shí)IP1沉默，或通過(guò)藥物necrostatin-1預(yù)處理，后加入谷氨酸或TNF-誘導(dǎo)，觀察RIP1的下調(diào)與necrostatin-1預(yù)處理對(duì)谷氨酸或TNF-誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的影響是否一致。并用western blot檢測(cè)其siRNA的干擾效率。利用RIP3缺失的MEF細(xì)胞，以及通過(guò)用siRNA干擾降低RIP3表達(dá)的HT22細(xì)胞，檢測(cè)RIP3的缺失或下調(diào)對(duì)谷氨酸或TNF-誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的影響，以判斷TNF-誘導(dǎo)壞死的關(guān)鍵蛋白R(shí)IP3是否參與谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡信號(hào)通路。

通過(guò)siRNA干擾的方法下調(diào)線粒體蛋白凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis inducing factor，AIF）的表達(dá)，以判斷AIF在谷氨酸或TNF-誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中的作用；通過(guò)使用自噬及溶酶體的化學(xué)抑制劑balfilomycin-A1(BFA)，Chloroquine(CQ)，3-Methyladenine(3-MA)以及活性氧ROS的化學(xué)抑制劑butylated hydroxyanisole(BHA)，N-acetylcysteine(NAC)以判斷谷氨酸或TNF-誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡與自噬或溶酶體及活性氧的關(guān)系。

參考文獻(xiàn)

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