背景[1-6]
實(shí)時(shí)熒光定量PCR服務(wù)是當(dāng)今生物學(xué)研究的重要手段之一。包括基礎(chǔ)科學(xué)、生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)研究、法醫(yī)學(xué)、診斷學(xué)等在內(nèi)的各領(lǐng)域的科學(xué)家們使用這種方法進(jìn)行廣泛的應(yīng)用研究。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的主要優(yōu)點(diǎn)是能夠準(zhǔn)確地確定初始模板拷貝數(shù)，具有較寬的動(dòng)態(tài)范圍以及較高的靈敏度，滿足定性和定量實(shí)驗(yàn)的需求?？茖W(xué)研究中較為常用的是SYBR Green qPCR和T aqMan探針qPCR。實(shí)時(shí)熒光定量PCR在PCR擴(kuò)增過程中，通過熒光信號(hào)，對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。
由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是將標(biāo)記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后，完成高溫變性，低溫復(fù)性，適溫延伸的熱循環(huán)，并遵守聚合酶鏈反應(yīng)規(guī)律，與模板DNA互補(bǔ)配對(duì)的Taqman探針被切斷，熒光素游離于反應(yīng)體系中，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，被擴(kuò)增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長(zhǎng)，通過實(shí)時(shí)檢測(cè)與之對(duì)應(yīng)的隨擴(kuò)增而變化熒光信號(hào)強(qiáng)度，求得Ct值，同時(shí)利用數(shù)個(gè)已知模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，即可得出待測(cè)標(biāo)本目的基因的拷貝數(shù)。
服務(wù)內(nèi)容：
①引物設(shè)計(jì)與合成；
②RNA抽提純化；
③基因組DNA消化處理；
④RNA質(zhì)量檢測(cè)；
⑤cDNA合成；
⑥實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)；
⑦提交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和報(bào)告。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡(jiǎn)述如下：
1. TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的首選技術(shù)平臺(tái)。
2.SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。
3.分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會(huì)產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對(duì)，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光。
應(yīng)用[7][8]
實(shí)時(shí)熒光定量PCR服務(wù)可用于蛋白組學(xué)研究中的轉(zhuǎn)錄水平的驗(yàn)證服務(wù)：
在低溫脅迫下擬南芥差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究中以模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)為材料,利用雙向電泳、質(zhì)譜技術(shù)并結(jié)合熒光定量PCR方法,對(duì)低溫脅迫條件下的擬南芥進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)組的比較分析,以探索植物的抗寒機(jī)制。實(shí)驗(yàn)中對(duì)蛋白質(zhì)樣品制備、上樣方式、雙向電泳參數(shù)的選擇等技術(shù)環(huán)節(jié)進(jìn)行了優(yōu)化,建立了適合擬南芥蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)平臺(tái)。同時(shí)進(jìn)行了蛋白質(zhì)樣品的分級(jí)制備研究,提高了低豐度蛋白的檢測(cè)效果。
2-DE圖譜分析結(jié)果表明,在低溫脅迫條件下,共檢測(cè)到67個(gè)蛋白豐度差異表達(dá)變化在2倍以上的蛋白點(diǎn)。對(duì)其中的57個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行了MALDI-TOF-MS分析,有42個(gè)蛋白點(diǎn)得到了有效鑒定,包括9個(gè)已知的低溫脅迫響應(yīng)蛋白和在本實(shí)驗(yàn)中首次發(fā)現(xiàn)的一些低溫應(yīng)答蛋白。這些蛋白在代謝、能量、防御反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了其中32個(gè)蛋白在轉(zhuǎn)錄水平上的變化,結(jié)果顯示mRNA與蛋白質(zhì)水平的變化并不完全一致。
參考文獻(xiàn)
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[6]Expression profiles of the Arabidopsis WRKY gene superfamily during plant defense response[J].Jixin Dong,Chunhong Chen,Zhixiang Chen.Plant Molecular Biology.2003(1)
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